[发明专利]从木本植物材料中提取叶绿体总RNA及同时提取总蛋白质的方法、叶绿体总蛋白质的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物中有机成分的提取和应用，尤其涉及一种植物中叶绿体总RNA和总蛋白质的提取以及总蛋白质的具体应用。

背景技术

我国作为茶树发源地，其品种资源非常丰富，种植规模也在逐年扩大，现已成为我国重要的经济作物。随着茶叶所具有的各种保健功能逐步被人们所发现，茶叶作为世界三大饮料之一，愈来愈受到消费者的青睐，茶叶消费量也在逐步提高，如何提高茶叶产量以满足快速增长的市场需求，已成为茶叶种植户及科技工作者的共同目标和重要课题。

叶绿体是绿色植物进行光合作用重要场所，植物通过光合作用吸收光能将二氧化碳和水合成有机物，光合作用的效率与植物产量密切相关。开展茶树叶绿体发育和作用机制的研究是提高茶树产量的有效途径之一；另一方面，对于茶树品种的遗传改良等也具有非常积极的意义。

RNA和蛋白质一直是分子生物学研究的主要内容。叶绿体作为植物的亚细胞器，往往仅能从植物材料中获得少量完整的叶绿体样品。因此，如何从少量珍贵茶树样品中获得高品质、高纯度、完整的叶绿体RNA和蛋白质，对于茶树分子生物学研究显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种步骤简单、操作方便、成本低、且产品纯度高无污染的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，还提供一种步骤简单、材料利用率高、工艺效率高、成本低、产品纯度质量较好的从木本植物材料中同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法，还提供提取的叶绿体总蛋白质样品在二硫苏糖醇-聚丙烯凝胶电泳分析、蛋白质免疫印迹或蛋白质双向电泳等分析中的具体应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，包括以下步骤：

（1）叶绿体纯化：按照常规方法从木本植物材料的叶片中进行粗提、纯化，得到叶绿体材料；

（2）冻融处理：将上述纯化后的叶绿体材料加入交联聚乙烯吡咯烷酮中，所述叶绿体材料与交联聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1∶1～3，然后于-20℃～-80℃温度下进行冻融处理（重复2～3次即可）；

（3）抽提总RNA：将经过冻融处理后的叶绿体材料加入冰浴预冷的Trizol试剂中，并加入冰浴预冷的氯仿，剧烈振荡后室温静置，再高速离心使抽提液分层，取分层后的上层水相加入冰浴预冷的异丙醇中，室温放置；再高速离心，弃去上清液，离心后的沉淀经洗涤、离心分离后，即得到所述木本植物材料的叶绿体总RNA。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，优选的，所述Trizol试剂按照每0.05g～0.10g叶绿体材料加入1mL的添加量进行添加；所述氯仿按照每1mL Trizol试剂添加0.15mL～0.20mL氯仿的添加量进行添加；所述异丙醇按照每1ml Trizol试剂添加0.30 mL～1.50 mL异丙醇的添加量进行添加。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，优选的，所述高速离心时的条件为10000～30000×g、0℃～10℃条件下离心10min～30 min；所述离心分离时的条件为5000～10000×g、0℃～10℃条件下离心3min～10 min。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，所述步骤（1）中的粗提优选包括以下步骤：将所述木本植物材料的叶片破碎，置入3～6倍于其体积且-20℃～-80℃预冷后的粗提缓冲液中，经匀浆、过滤后所得的叶片匀浆滤液再进行离心处理，100～300×g、0℃～10℃条件下离心5min～10 min，弃沉淀；离心后的上清液再进行二次离心处理，1000～3000×g、0℃～10℃条件下离心10min～20min，弃上清，所得沉淀即为叶绿体粗提物。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，所述步骤（1）中的纯化包括以下步骤：将所述叶绿体粗提物加入Percoll母液和氯化钠溶液构成的密度梯度体系中，2000～4000×g、0℃～10℃条件下离心10min～20min，收集密度梯度分界面的绿色条带，再用1～3倍于其体积且预冷后的纯化缓冲液重悬，2000～4000×g、0℃～10℃条件下离心10 min～20min，所得沉淀即为纯化后的叶绿体材料。

上述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，所述木本植物优选为茶树。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种从木本植物材料中同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法，包括以下步骤：

（a）按照上述的方法先提取得到所述叶绿体总RNA；