[发明专利]从木本植物材料中提取叶绿体总RNA及同时提取总蛋白质的方法、叶绿体总蛋白质的应用

权利要求书

1.一种从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，包括以下步骤：

（1）叶绿体纯化：按照常规方法从木本植物材料的叶片中进行粗提、纯化，得到叶绿体材料；

（2）冻融处理：将上述纯化后的叶绿体材料加入交联聚乙烯吡咯烷酮，所述叶绿体材料与交联聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1∶1～3，然后于-20℃～-80℃温度下进行冻融处理；

（3）抽提总RNA：将经过冻融处理后的叶绿体材料加入冰浴预冷的Trizol试剂中，并加入冰浴预冷的氯仿，剧烈振荡后室温静置，再高速离心使抽提液分层，取分层后的上层水相加入冰浴预冷的异丙醇中，室温放置；再高速离心，弃去上清液，离心后的沉淀经洗涤、离心分离后，即得到所述木本植物材料的叶绿体总RNA。

2.根据权利要求1所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于：所述Trizol试剂按照每0.05g～0.10g叶绿体材料加入1.0 mL的添加量进行添加；所述氯仿按照每1.00 mL Trizol试剂添加0.15 mL～0.20 mL氯仿的添加量进行添加；所述异丙醇按照每1ml Trizol试剂添加0.30 mL～1.50 mL异丙醇的添加量进行添加。

3.根据权利要求1所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于：所述高速离心时的条件为10000～30000 ×g、0℃～10℃条件下离心10min～30 min；所述离心分离时的条件为5000～10000×g、0℃～10℃条件下离心3min～10 min。

4.根据权利要求1所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的粗提包括以下步骤：将所述木本植物材料的叶片破碎，置入3～6倍于其体积且-20℃～-80℃预冷后的粗提缓冲液中，经匀浆、过滤后所得的叶片匀浆滤液再进行离心处理，100～300×g、0℃～10℃条件下离心5min～10 min，弃沉淀；离心后的上清液再进行二次离心处理，1000～3000×g、0℃～10℃条件下离心10min～20min，弃上清，所得沉淀即为叶绿体粗提物。

5.根据权利要求4所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的纯化包括以下步骤：将所述叶绿体粗提物加入Percoll母液和氯化钠溶液构成的密度梯度体系中，2000～4000×g、0℃～10℃条件下离心10 min～20min，收集密度梯度分界面的绿色条带，再用1～3倍于其体积且预冷后的纯化缓冲液重悬，2000～4000×g、0℃～10℃条件下离心10 min～20min，所得沉淀即为纯化后的叶绿体材料。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的从木本植物材料中提取叶绿体总RNA的方法，其特征在于，所述木本植物为茶树。

7.一种从木本植物材料中同时提取叶绿体总RNA和叶绿体总蛋白质的方法，包括以下步骤：

（a）按照权利要求1～6中任一项所述的方法先提取得到所述叶绿体总RNA；

（b）沉淀DNA：向所述抽提液分层后保留的中间层和下层有机相中加入无水乙醇，无水乙醇按每1ml Trizol试剂加入1.0 mL～1.5mL无水乙醇的添加量添加，室温孵育，离心后弃沉淀；

（c）沉淀蛋白质：将上述步骤（b）后的上清液加入-20℃～-80℃预冷后含醋酸铵的甲醇溶液中，-20℃～-80℃条件下沉淀，1h～5h，再经高速离心后弃上清液；得到的沉淀分别用甲醇溶液、丙酮溶液洗涤，得到所述木本植物材料的叶绿体总蛋白质。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤（b）中，离心的条件为1000～3000×g、0～10℃条件下离心3 min～10min；所述步骤（c）中，高速离心的条件为10000～20000×g、0～10℃条件下离心15min～30min；所述含醋酸铵的甲醇溶液中含有0.05 mol/L～0.25 mol/L醋酸铵、10mmol/L～25 mmol/L的二硫苏糖醇和2.0%～4.0%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂；所述甲醇溶液和丙酮溶液中均含10mmol/L～25 mmol/L的二硫苏糖醇和2.0%～4.0%体积分数的Cocktail蛋白抑制剂。