[发明专利]一种荧光标记的氨基糖苷类腺苷修饰酶及其检测抗生素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光标记的氨基糖苷类腺苷修饰酶及其检测抗生素的方法，主要用于食品安全、医疗卫生和环境监测等领域的抗生素药物残留的检测和定量分析。

背景技术

自1940年青霉素发现以来，数以千计的抗生素被开发用以传染性疾病的临床治疗，挽救了无数人的生命。但是随着抗生素广泛而大量地使用，许多细菌已经对它的对手产生了耐药性，很多药物不再像以前那样有效，甚至产生毒副作用。2010年8月11日,世界著名医学期刊《柳叶刀》刊文报道，带有一种特殊基因NDM-1(新德里一号金属酶)的肠杆菌科细菌，对绝大多数常用抗生素耐药[Kumarasamy K K, et al., The Lancet Infectious Diseases, 2010, 9, 597-602, French G L, International Journal of Antimicrobial Agents, 2010, 36, S3-S7]。该报道立即引起广泛关注，媒体称之为“超级细菌”。随着全球感染人数的不断增加，引起人们对其全球蔓延趋势的担忧甚至恐慌。其实耐药型的细菌并非新事物，它们一直存在并且随着人类滥用抗生素而进化出强大耐药性，在这场特殊博弈中，人类是超级细菌的幕后推手。

抗生素的滥用是一个全球性的问题，特别是中国已成为世界上滥用抗生素最为严重的国家之一。据2006-2007年度卫生部全国细菌耐药监测结果显示，全国医院抗菌药物年使用率高达74％。而在美英等发达国家，医院的抗生素使用率仅为22％～25％。中国的住院患者中，抗生素的使用率则高达70%，其中外科患者几乎人人都用抗生素，比例高达97%。我国每年因药物不良反应死亡20万人，其中因滥用抗生素死亡人数就达8万人[Andreas H, et al., The Lancet, 2009,373, 30]。除了医疗卫生，动植物养殖，食品以及水质、环境中抗生素的滥用也日益严重，其影响不容小觑，特别是动物源性食品中抗生素严重超标，长期食用有抗食品，可在体内积累，抗生素的负作用会使身体器官受损，破坏体内的正常菌群，致使消费者的耐药性在不知不觉中增强，等于在人体内埋下“隐形炸弹”，将来一旦患病，很可能无药可医[Broughton E I, et al., Food Policy, 2010, 35, 471-478]。

瑞典传染病控制研究所的安德里亚斯·赫迪尼(Andreas Heddini)警告说，如果滥用抗生素的势头不能得到有效遏制，人类很可能重返前抗生素时代。世界卫生组织已成立了慎用抗生素联盟，其成员包括90多个国家，各国采取严厉的手段限制使用抗生素。我国主管部门也加强了对抗生素使用的监管，例如，国家药监局规定在零售药店销售必须凭执业医师处方才能销售抗生素类处方药，对食品、水质环境中抗生素类药品所占的比例限定标准；加强药物、食品中抗生素的检测。这些措施在促进抗生素合理使用方面发挥了一定的作用。

目前食品、环境中常用的抗生素检测方法为高效液相色谱、串联质谱方法，这些方法比较标准，具有分离能力强和较高的灵敏度，但是都要用到大型昂贵仪器，如色谱仪、质谱仪，且耗时长，技术流程较为复杂，需要专业人员操作，对现场检测，初选来说，很不现实[Holzgrabe U, et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011, 56, 271-279]。还有较快速的方法，如酶联免疫法以及微生物检测法，对实验条件要求也比较高，且试剂易受污染，准确度和专属性不高，时间性强等特点，也不理想[Makvandi-Nejad S, et al., Journal of Immunological Methods, 2010, 360, 103-118]。因此，一种实时快速、便捷灵敏的抗生素检测方法和便携设备亟待开发，这对于食品安全、环境卫生监管等尤为迫切，将在遏制抗生素滥用方面发挥重要的作用。

氨基糖苷类腺苷修饰酶（ANT(4’)）是细菌产生的一种钝化酶，共价修饰抗生素的某些特定基团，干扰抗生素和核糖体的结合，从而使抗生素失去药效。它修饰的底物具有广谱性，多达数十种，是一个很好的模型蛋白[Revuelta J, et al. J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 5086–5103, Wu C H, et al. J. Phys. Chem. B, 2012, 116, 5644–5652]。

发明内容