[发明专利]人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是利用狂犬病毒PM株在人二倍体细胞上制备病毒液的方法。

背景技术

狂犬病在100多个国家均有流行。全世界超过33亿人居住在狂犬病流行地区，尤其是亚洲和非洲。人类感染狂犬病病毒后，一旦出现临床症状几乎100%死亡，99%的死亡由犬狂犬病造成，除家犬外很多肉食动物和蝙蝠也可以向人类传播狂犬病病毒。亚洲是狂犬病高发地区，约占全球因犬伤所致人狂犬病死亡病例的90%。2000年，在亚洲15个狂犬病流行国家生活的31.1亿人口中，约37000人死于狂犬病。大多数人由于暴露于狂犬病病毒潜在感染，而没有接受治疗或者注射任何疫苗而导致死亡。卫生部2009年、2010年全国法定传染病报告发病、死亡统计表中，狂犬病的死亡率第一，死亡数第三，狂犬病已成为我国最严重的公共卫生问题之一。

根据我国人用狂犬病疫苗的使用量每年被动物伤害的人数超过1000万人。为满足我国国内市场的需求，国内很多厂家都在生产狂犬疫苗，主要包括原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞和Vero传代细胞疫苗。这些疫苗都存在异源蛋白，外源因子，DNA污染等各种不同的风险因素。另外原代细胞培养需每批疫苗须检查培养器官源的杂质（细菌、支原体、病毒），并且动物器官的可用量是限制工业化生产的因素；而Vero细胞属于猴源细胞，宿主DNA残留比较高，存在致瘤风险。国外生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗，如美国Wyeth厂，法国Sanofi Pasteur厂和德国Behring厂生产的二倍体疫苗，具有高免疫原性和良好的耐受性，和无异源蛋白的不良影响，目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用。

因目前国内人用二倍体狂犬病疫苗所使用的MRC-5细胞基质来源于ATCC，而ATCC明确指出仅供研究用，考虑到未来狂犬病疫苗工业化生产，故本研究所使用的MRC-5细胞来源于Sanofi Pasteur的细胞生产库，Sanofi Pasteur的细胞生产库是从NIBSC得到早代细胞建立而成的，狂犬病毒PM株亦购买于Sanofi Pasteur的病毒生产库，MRC-5细胞和PM病毒签订协议允许可用于狂犬病疫苗的生产。为本发明的大规模生产提供了有力的保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法。

本发明提供一种人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法，是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒PM株，培养病毒感染的人用二倍体细胞得到狂犬病毒液，所用的人用二倍体细胞是MRC-5。

本发明的人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法，包括如下步骤：

（1）MRC-5细胞的复苏与扩培；

（2）在MRC-5细胞上接种狂犬病病毒PM株；

（3）接种PM毒株后的MRC-5细胞继续传代扩培；

（4）冲洗细胞，之后加入病毒培养液

（5）收获病毒液。

其中，步骤（1）的MRC-5细胞在15~25℃的水浴中复苏，5~9h后更换细胞培养液。

其中步骤（1）细胞扩增按照1：2~1:4的比例传代扩增培养，得到细胞悬液。

其中，步骤（2）按照0.05-0.1MOI接种狂犬病毒至细胞悬液，36℃-38℃水浴保温13-17min，之后继续培养。

步骤（2）按照1:2~1:4的比例分种36~38℃培养20-25h后，调温至33~36℃继续培养。

其中，步骤（3）的方法是先用PBS溶液洗涤细胞面，再用胰酶消化细胞，用细胞培养液重悬细胞，制成病毒细胞悬液。按照1：2~1:4的比例分种。

本发明的制备方法中，步骤（1）、（2）、（3）中MRC-5细胞培养液为含10%~20%胎牛血清的BME培养液，pH值为6.90~7.20，渗透压为300~340mosm/kg，不含抗生素。

进一步地，步骤（1）、（2）、（3）细胞培养温度为33~38℃。

进一步地，步骤（4）、（5）细胞培养温度为33~36℃。

其中，步骤（4）中使用的冲洗液为BME液，pH值为6.80~7.10，渗透压为290-320mosm/kg，不含抗生素。