[发明专利]人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法

权利要求书

1.一种人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法，其特征在于，在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒PM株，培养病毒感染的人用二倍体细胞得到狂犬病毒液，所述的人用二倍体细胞是MRC-5。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）MRC-5细胞的复苏与扩培；

（2）在MRC-5细胞上接种狂犬病病毒PM株；

（3）接种PM毒株后的MRC-5细胞继续传代扩培；

（4）冲洗细胞，之后加入病毒培养液

（5）收获病毒液。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）的MRC-5细胞在15-25℃的水浴中复苏，5-9h后更换细胞培养液。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）按照0.05-0.1MOI接种狂犬病毒至细胞悬液，36℃-38℃水浴保温13-17min，之后继续培养。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）的方法是先用PBS溶液洗涤细胞面，再用胰酶消化细胞，用细胞培养液重悬细胞，制成病毒细胞悬液，培养2~3d。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）、（2）、（3）中MRC-5细胞的培养液为含10%~20%胎牛血清的BME培养液，pH值为6.90-7.20，渗透压为300-340mosm/kg，不含抗生素。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中病毒培养液为含0.2%~0.5%人血白蛋白的BME培养液，pH值为7.30-8.00，渗透压为310-350mosm/kg，不含抗生素。

8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）冲洗细胞的方法为：先用冲洗液冲洗细胞表面，所述冲洗液为BME液，pH值为6.80~7.10，渗透压为290-320mosm/kg，不含抗生素；然后加入人白培养液培养16-20h，所述人白培养液为含0.2%~0.5%人血白蛋白的BME液，pH值为6.80-7.10，渗透压为290-320mosm/kg，不含抗生素；用冲洗液进行第二次细胞面的冲洗，之后加入病毒培养液培养3~4d。

9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括病毒液收获后进行浓缩的步骤。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中病毒液的滴度不低于6.5LgCCID₅₀/ml，浓缩后病毒液的滴度不低于7.5LgCCID₅₀/ml且效价不低于4.0IU/ml。