[发明专利]感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体检测试剂盒及其检测方法，具体地，涉及一种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

水泡性口炎(Vesicular stomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus，VSV)引起的一种急性高度接触性传染病，马、牛、猪等动物较易感。临床上以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水泡病变为主要特征。VS在临床症状上很难与口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SV)、猪水疱性疹(VES)区别开来。据国际兽医局(OIE)报道，南美、中美几乎所有的国家和地区以及北美的美国等国家在1996-2002年暴发了大面积的VS流行，造成严重的经济损失。VS常呈季节性暴发，多在夏秋季(7～8月)发生，秋末趋于平息。节肢动物可能在病毒的传播中起到一定的作用，许多病例还表现为地方流行性及易感动物间的直接传播，水泡性口炎被OIE列为A类疾病，在我国其为外来动物传染病，还未有大规模爆发的报道，国家进出境动物检疫对象中将VSV列为二类疫病。

VSV分为两个血清型，一是印地安那型(VSV_IND)，另一是新泽西型(VSV_NJ)。VSV基因组为线状单股负链RNA，全长约11Kb，从RNA的3’到5’端依次排列着5个相互不重叠的基因，分别编码病毒的核衣壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、囊膜蛋白(G)和病毒RNA复制酶(L)。

VSV M蛋白是一个分子量约26kDa的非糖基化的蛋白，是导致VSV致病性的重要毒力因子，M蛋白在细胞内具有多重功能，包括稳定病毒囊膜上的G蛋白三聚体；参与病毒体装配；抑制病毒RNA合成等，更重要的是，它可以阻遏宿主细胞mRNAs由胞核向胞外的转运，并以此有效地干扰宿主细胞表达抗病毒I型干扰素，使得病毒得以在宿主内有效复制。

目前，监测VSV感染动物抗体主要采用中和实验，而对重要毒力因子M蛋白的抗体还无有效的监测方法，因此，开发出一种能够快速诊断VSV感染的试剂盒成为当务之急。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法，本发明提供的试剂盒能够快速检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体，耗时少，使用方便，而且结果特异性强、敏感性高，有利于及时监测入境动物的VSV感染情况。

本发明的第一个目的通过以下技术方案实现，一种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒，包括重组M蛋白抗原、多孔酶联板、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、HRP标记的羊抗鼠IgG、终止液、TMB底物溶液、阴性对照血清和阳性对照血清。

优选的，所述重组M蛋白抗原为TrxA-M重组蛋白抗原或含GST标签的重组M蛋白抗原。

优选的，所述TrxA-M重组蛋白抗原通过以下步骤制备：

步骤一，根据VSV基因组序列设计引物对VSV M基因进行PCR扩增；

步骤二，将质粒pET32a(+)和PCR扩增得到的所述M基因分别用BamHI与HindIII双酶切并分别回收，用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态菌株，37℃培养过夜后，挑取菌落进行培养后抽提质粒DNA，进行BamHI与HindIII双酶切鉴定和DNA测序鉴定，获得pET32a-M质粒；

步骤三，将所述pET32a-M质粒转化大肠杆菌BL21表达宿主菌，以终浓度为1mM的IPTG诱导TrxA-M重组蛋白的表达；

步骤四，超声破碎所述宿主菌，12000rpm离心30min，对破碎菌体上清及沉淀分别采用12％的SDS-PAGE检测目的蛋白；

步骤五，采用Ni-NTA Resin纯化所述重组蛋白，采用12％的SDS-PAGE胶鉴定纯化产物，并用VSV小鼠康复血清及His单克隆抗体进行Western-blotting鉴定M蛋白。

优选的，所述包被缓冲液为pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液。

优选的，所述封闭缓冲液由含3％的脱脂奶粉的PBS和0.05％Tween20组成，所述百分比为重量体积百分比。

优选的，所述洗涤缓冲液为pH7.4的0.15M PBS。

优选的，所述样品稀释液由0.1gBSA加所述洗涤缓冲液至100mL而获得。

优选的，所述多孔酶联板为40孔或96孔的聚苯乙烯塑料板。