[发明专利]感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括重组M蛋白抗原、多孔酶联板、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、HRP标记的羊抗鼠IgG、终止液、TMB底物溶液、阴性对照血清和阳性对照血清。

2.如权利要求1所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述重组M蛋白抗原为TrxA-M重组蛋白抗原或含GST标签的重组M蛋白抗原。

3.如权利要求2所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述TrxA-M重组蛋白抗原通过包括以下步骤的方法制备而得：

步骤一，根据VSV基因组序列设计引物对VSV M基因进行PCR扩增；

步骤二，将质粒pET32a(+)和PCR扩增得到的所述M基因分别用BamHI与HindIII双酶切并分别回收，用T4连接酶连接，连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌菌株，37℃培养过夜后，挑取菌落进行培养后抽提质粒DNA，进行BamHI与HindIII双酶切鉴定和DNA测序鉴定，获得pET32a-M质粒；

步骤三，将所述pET32a-M质粒转化大肠杆菌BL21表达宿主菌，以终浓度为1mM的IPTG诱导TrxA-M重组蛋白的表达；

步骤四，超声破碎所述宿主菌，12000rpm离心30min，对破碎菌体上清及沉淀分别采用12％的SDS-PAGE检测目的蛋白；

步骤五，采用Ni-NTA Resin纯化所述重组蛋白，采用12％的SDS-PAGE胶鉴定纯化产物，并用VSV小鼠康复血清及His单克隆抗体进行Western-blotting鉴定M蛋白。

4.如权利要求1所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液。

5.如权利要求1所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述封闭缓冲液由含3％的脱脂奶粉的PBS和0.05％Tween20组成，所述百分比为重量体积百分比。

6.如权利要求1所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液为pH7.4的0.15M PBS。

7.如权利要求1所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液由0.1gBSA加所述洗涤缓冲液至100mL的比例配制而得。

8.如权利要求1所述的感染VSV的动物体内M蛋白抗体的检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M硫酸。

9.一种应用权利要求1所述的试剂盒检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，重组M蛋白抗原用0.05M pH9.6的碳酸缓冲液稀释，4℃包被过夜，洗涤缓冲液洗涤；

步骤二，用封闭缓冲液37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；

步骤三，将待测血清用样品稀释液倍比稀释后，37℃孵育2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；

步骤四，加入用封闭缓冲液稀释为1∶5000的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1.5h，用洗涤缓冲液洗涤；

步骤五，于各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL，37℃保温10～30分钟；

步骤六，于各反应孔中加入0.05mL终止液；

步骤七，在ELISA检测仪上，于450nm处以空白对照孔调零后测各孔OD值，以待测血清OD值/阴性对照OD值＞2.1作为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为该血清样品的抗体滴度。

10.如权利要求9所述的检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体的方法，其特征在于，所述重组M蛋白抗原的包被浓度为12.5μg/mL。