[发明专利]一种人巨细胞病毒HCMV检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种人巨细胞病毒HCMV检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的HCMV-DNA检测试剂盒。

背景技术

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）亦称细胞包涵体病毒，为疱疹病毒科β属的双螺旋DNA病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体，所以称为巨细胞病毒。CMV可感染人和其他哺乳动物，但具有高度的宿主特异性，人是HCMV的唯一宿主。人大多感染过HCMV，但多呈无临床症状的急性感染或潜伏感染，且大多在少儿期因感染而获得免疫。HCMV是一种机会致病性病毒，病毒可长期潜伏在体内，甚至终身带毒，但其在免疫功能不成熟或缺陷的人群（如艾滋病和器官移植患者等）中，潜伏的HCMV可被激活而引起严重疾病。同时，HCMV也是人类先天性感染最常见的病原之一，可对胎儿造成不可逆的损害，分娩后治疗无任何意义，必须在损害发生前及早诊断和治疗。由于HCMV对人类健康造成了很大的威胁，对这种疾病的临床感染诊断的时效性，精确性的要求也越来越高。

目前HCMV感染常用的实验室诊断方法有血清学检查、抗原血症检测及基于PCR技术的检测方法等。血清学方法很多，包括补体结合试验、间接血凝试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验和放射免疫试验。其中酶联免疫吸附试验是最常用的方法，酶联免疫吸附技术不需要特别的荧光显微镜，又可避免放射性同位素对人体的伤害，且酶标物的有效期长，便于保存，有灵敏度高、特异性好和重复性好等长处，方法简单，不需要特殊仪器，但该方法灵敏度明显不如抗原血症检测，且不利于早期诊断。最常用于抗原血症检测的抗原为pp65，它是HCMV活动性感染的早期标志性产物，是目前监测HCMV活动性感染和指导抗病毒治疗的重要方法，但是pp65抗原血症检测仅适合于血标本，且标本要求及时处理（一般在4小时内）。PCR技术由于高灵敏度、高特异性、快速、简便等优点，使其为人巨细胞病毒的检测提供了又一新的途径。定量PCR的出现，打破PCR只能定性的局面，其中荧光定量PCR以其高灵敏度、高特异性、低污染率、实时监测等特点，可为临床提供更加准确、客观的检测结果，并及时地了解病情及预后。

运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。

目前国内临床上主要采用直接煮沸法对血清样本中的人巨细胞病毒核酸进行提取，具体是向血清中加入某种核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板；该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对高浓度的样本裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。而对尿液或乳汁样本中的人巨细胞病毒核酸进行提取也主要采用煮沸法，具体是先将样本浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板；浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样会导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀则使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。

临床上检测HCMV-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值（即定量检测）。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。