[发明专利]高危型人乳头瘤病毒HPV16/18检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种高危型人乳头瘤病毒HPV16/18检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的HPV16/18-DNA检测试剂盒。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一类分子量较小的无包膜的双链环状DNA病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上，根据HPV不同亚型的致病力大小或致癌危险性大小可将HPV分为高危型和低危型两大类。

高危型HPV除引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型。宫颈癌是最常见的妇科肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于乳腺癌，在发展中国家则居首位。1995年，国际癌症研究机构(IARC)专题讨论会通过——HPV感染是宫颈癌的主要原因，即HPV感染是宫颈癌发生的必要条件。在中国，宫颈癌的发病率日趋升高，每年约有15万新发病例，占世界新发病例的30%。HPV16和/或18型是普遍流行的感染率最高的致癌型别。来自世界范围的子宫颈癌组织标本的研究发现：HPV16和18型感染率最高。在检出的所有型别中，HPV16占50%，HPVl8占14%。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，因此，快速、准确的检测出HPV16型和18型对于HPV高危型感染的诊断、早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。

目前宫颈癌的筛查主要是基于细胞学的检测方法，有宫颈巴氏(Pap)涂片、液基薄层细胞学、薄片制备细胞学检查(TCT)或阴道镜活检等多种。宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30%。TCT法大大改进了细胞学检查的准确性，逐渐取代传统的巴氏法。阴道镜检查可观察宫颈上皮血管微小变化、其虽敏感、准确，但会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受；宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。由于宫颈HPV感染多为隐性亚临床感染，且HPV不能在培养环境中稳定生长，大部分HPV感染无临床症状或为亚临床感染但可致严重后果，只能通过HPV DNA检测得知，因此，分子生物学技术渐渐显现了其在检测上的优势，目前认为PCR技术是检测HPV DNA及分型的最好方法。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。大量研究表明用PCR技术检测HPV DNA的阳性率远高于其他检测技术，是当今用于尖锐湿疣以及HPV感染诊断最常用的有力工具，且能更好的应用于HPV致病、致癌机理的研究之中。

运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。

目前国内临床上主要采用煮沸法对人乳头瘤病毒的核酸进行提取，具体是先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对高浓度的样本裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染；另外，对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到；看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的则会使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。