[发明专利]番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基因沉默表达载体，还涉及该基因沉默表达载体的构建方法，以及该基因沉默表达载体在植物育种中的应用。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)为茄科的一种重要农作物，是全世界栽培最为普遍的果菜之一。必需脂肪酸是机体生命活动必不可少，但机体自身不能合成或合成速度慢无法满足机体需要，必须由食物供给的多不饱和脂肪酸，主要包括α-亚麻酸和亚油酸两种。基因工程育种目前已成为植物育种领域的一个重要分支，在定向改良植物特性方面显示出极大的潜力。近年来，利用转基因技术增加番茄的抗病虫、抗除草剂和抗盐碱性能的报道相对较多，但利用转基因技术提高番茄果实中不饱和脂肪酸含量尚未见报道。

植物脂肪氧化酶(LOX)是一类含非血红素铁的蛋白质，专一催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸(包括α-亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸等)的加氧反应，氧化生成具有共轭双键的过氧化氢物。因此，沉默番茄脂肪氧化酶家族的表达，有望提高番茄中具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸特别是必需脂肪酸的含量。番茄中存在五个LOX同工酶基因：TomloxA、TomloxB、TomloxC、TomloxD和TomloxE。其中，TomloxA、TomloxB和TomloxE相互之间的氨基酸序列一致性为72%-77%，TomloxC和TomloxD与TomloxA的氨基酸序列一致性分别为42%和47%，TomloxC与TomloxD的氨基酸序列一致性为46%；TomloxA、TomloxB和TomloxE在果实中表达，TomloxC在成熟果实的转色期和红熟期可以检测到，在叶片和花器中也有表达，而TomloxD主要在番茄叶中表达。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体，目的之二在于提供所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的构建方法，目的之三在于提供含有所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的微生物转化体，目的之四在于提供所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体在番茄植株育种中的应用，目的之五在于提供利用所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体进行番茄植株育种的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1．番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体，含有一个双链RNA表达单元，所述双链RNA表达单元包括启动子、TomloxACD拼接基因正向片段、TomloxACD拼接基因反向片段和终止子，所述TomloxACD拼接基因由TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段拼接而成，所述TomloxA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述TomloxC基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述TomloxD基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步，所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体是以pBIN19载体为骨架，双链RNA表达单元插入pBIN19载体的多克隆位点中，所述双链RNA表达单元包括CaMV 35S启动子、TomloxACD拼接基因正向片段、GFP基因开放读码框、TomloxACD拼接基因反向片段和CaMV 35S终止子。

2．所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的构建方法，包括以下步骤：

a．TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段的克隆：以野生型番茄幼叶总RNA为模板，反转录得到cDNA第一链，再以所得cDNA第一链为模板，分别以TomA-f和TomA-r、TomC-f和TomC-r、TomD-f和TomD-r为引物，PCR扩增TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段，所述TomA-f和TomA-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述TomC-f和TomC-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，所述TomD-f和TomD-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；然后，将所得TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段分别与pMD18-T载体连接，获得重组质粒TomloxA-T、TomloxC-T和TomloxD-T；