[发明专利]番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体，其特征在于，含有一个双链RNA表达单元，所述双链RNA表达单元包括启动子、TomloxACD拼接基因正向片段、TomloxACD拼接基因反向片段和终止子，所述TomloxACD拼接基因由TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段拼接而成，所述TomloxA基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述TomloxC基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述TomloxD基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体，其特征在于，以pBIN19载体为骨架，双链RNA表达单元插入pBIN19载体的多克隆位点中，所述双链RNA表达单元包括CaMV 35S启动子、TomloxACD拼接基因正向片段、GFP基因开放读码框、TomloxACD拼接基因反向片段和CaMV 35S终止子。

3.权利要求1或2所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a．TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段的克隆：以野生型番茄幼叶总RNA为模板，反转录得到cDNA第一链，再以所得cDNA第一链为模板，分别以TomA-f和TomA-r、TomC-f和TomC-r、TomD-f和TomD-r为引物，PCR扩增TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段，所述TomA-f和TomA-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述TomC-f和TomC-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，所述TomD-f和TomD-r的核苷酸序列分别如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；然后，将所得TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段分别与pMD18-T载体连接，获得重组质粒TomloxA-T、TomloxC-T和TomloxD-T；

b．TomloxA基因片段、TomloxC基因片段和TomloxD基因片段的拼接：将重组质粒TomloxA-T用BglII和SalI双酶切，回收纯化重组质粒TomloxA-T线性片段，另将重组质粒TomloxC-T用BamHI和SalI双酶切，回收纯化TomloxC基因片段，再将纯化的重组质粒TomloxA-T线性片段与TomloxC基因片段连接，获得重组质粒TomloxAC-T；然后，将重组质粒TomloxAC-T用SalI单酶切，回收纯化重组质粒TomloxAC-T线性片段，另将重组质粒TomloxD-T用XhoI和SalI双酶切，回收纯化TomloxD基因片段，再将纯化的重组质粒TomloxAC-T线性片段与TomloxD基因片段连接，获得重组质粒TomloxACD-T；

c．番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的构建：将重组质粒TomloxACD-T用XbaI和SphI双酶切，回收纯化TomloxACD拼接基因片段，再与经同样双酶切的pDHG5.2载体连接，获得重组质粒pDHG5.2-GFP-rTomloxACD-T35S；然后，将重组质粒TomloxACD-T用KpnI和BamHI双酶切，回收纯化TomloxACD拼接基因片段，再与经同样双酶切的重组质粒pDHG5.2-GFP-rTomloxACD-T35S连接，获得重组质粒pDHG5.2-P35S-fTomloxACD-GFP- rTomloxACD-T35S；再后，将重组质粒pDHG5.2-P35S- fTomloxACD-GFP-rTomloxACD-T35S用EcoRI单酶切，回收纯化P35S-fTomloxACD-GFP- rTomloxACD-T35S表达单元，再与经同样单酶切的植物表达载体pBIN19连接，即得番茄脂肪氧化酶家族基因沉默表达载体TomloxACDi-pBIN19。

4.含有权利要求1或2所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体的微生物转化体。

5.根据权利要求4所述的微生物转化体，其特征在于，所述微生物为农杆菌。

6.权利要求1或2所述番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体在高不饱和脂肪酸果实番茄植株育种中的应用，所述不饱和脂肪酸为具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸。