[发明专利]一种鱼类鲜度K值测定样品前处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析测试技术领域，尤其涉及一种改进的鱼类鲜度K值测定样品前处理方法。

背景技术

鲜度是水产品价值的重要衡量指标。K值是表示鲜度的一个指标，自1959年提出这个概念后，测定K值所需的提取ATP关联化合物的方法却没有很大改进。

鱼死亡早期，其自身的酶活性仍在活动，鱼的早期鲜度取决于自身的生物化学反应。将肌苷和次黄嘌岭之和对ATP 各级降鲜产物之和的比值即K值作为评定鱼类鲜度的重要化学指标，该法对鱼类鲜度进行评定行之有效，目前已为世界各国采用。测定的关键在于对鱼肉样品中所含核苷酸不同阶段的分解物进行定量。而核苷酸及其分解产物的提取是否充分，提取过程是否迅速高效，对K值的测定精度具有极大的影响。

传统的样品处理方法是将鱼肉在高氯酸中匀浆，使得与ATP及其关联产物分解相关的酶失活，同时抽提出酸可溶性核苷酸分解产物。离心分离上清液，沉淀多次重复抽提，最后合并上清液。为防止ATP在酸性条件下分解，抽提出的上清液应尽快用KOH中和。另外，采用KOH中和还能除去高氯酸，避免其阻碍ATP关联产物在后续离子交换树脂的吸附。以上操作，步骤较多，处理不便，多个步骤必然造成系统误差，导致测定精度的低下；且处理时间长，有可能导致ATP关联产物的非生理性分解，导致测定误差。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种改进的鱼类鲜度K值测定样品前处理方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种鱼类鲜度K值测定样品前处理方法，包括以下步骤：

（1）取0.8-1.2g鱼肉样品，放入容器中，添加质量浓度为2.5-10%的高氯酸的水溶液，鱼肉样品与高氯酸的水溶液的质量体积比为0.1（g/mL），在冰水浴条件下搅拌10-20分钟；

（2）往容器中添加浓度为1M的KOH，调节pH值至2-3.5；

（3）加蒸馏水或去离子水定容至20mL，通过0.45微米的微滤膜过滤除去可能含有的杂质。在滤液中添加0.2-1mL的浓度为0.1M、pH为7.5的磷酸缓冲液，即得到K值分析用的预处理样品。

本发明的有益效果是，本发明的方法简单易行，省时省力，降低对仪器的依赖，提高了处理效率，确保测定精度。

具体实施方式

一种鱼类鲜度K值测定样品前处理方法，包括以下步骤：

1、取0.8-1.2g鱼肉样品，放入容器中，添加质量浓度为2.5-10%的高氯酸的水溶液，鱼肉样品与高氯酸的水溶液的质量体积比为0.1（g/mL），在冰水浴条件下搅拌10-20分钟。

高氯酸可使鱼肉中含有的ATP及其关联产物分解酶类失活，传统方法为提高ATP及其关联产物的提取得率，采用匀浆的方法使得鱼肉微细化。但是，附聚在匀浆机器件及容器皿上的样品收集比较困难；样本较多时，匀浆处理亦耗时耗力。研究发现，若样品为0.8-1.2g，无论是直接在鱼肉中添加高氯酸，还是把鱼肉样品切成若干小块，或者经过细致均匀的剁碎，添加高氯酸水溶液后抽提出的核苷酸关联物的量测定结果没有明显的差异。故本发明略去细切、剁碎、匀浆的操作，直接在0.8-1.2g鱼肉样品中添加高氯酸，以玻璃棒搅拌，提取10-20分钟。

传统方法为确保ATP及其关联产物的提取得率，至少重复抽提2次以上，即通过离心分离，将上清液转移到其他容器中，所得沉淀继续添加高氯酸匀浆后再离心，弃去沉淀，合并上清液。研究发现，一次提取所得上清液中ATP及其关联产物的得率最高，重复抽提液中亦能测定到很低含量的产物。考虑传统方法中经离心分离操作，这些少量可测定产物很可能是附着在离心管壁上的残留物。另外，提取时间从5分钟到30分钟，所得结果大致相同。本发明结合后续步骤，省略多次离心转移容器的操作，采用1次高氯酸提取10-20分钟，无需离心，保留沉淀，直接进入后续的中和操作。

2、往容器中添加浓度为1M的KOH，调节pH值至2-3.5。