[发明专利]一种低分子量肝素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低分子量肝素的制备方法，尤其是利用非哺乳类鱼类资源，采用改进酶法提取高凝血酶活性低分子量肝素的方法。

 

背景技术

凝血是参与维持哺乳动物正常止血的生理途径，在血管受伤的情况下，凝血途径受到激发而形成血凝块，阻止血液损失，血管受伤发生后，血小板立即开始在受伤部位凝集形成物理堵塞物以阻止血液流失。此外，受伤血管也通过血管收缩来减少流经此区域的血流，而血纤维蛋白则开始凝集形成覆盖破裂区域的不溶性网络或凝块。

当凝血途径倾向于过量凝结的不平衡状态时，其结果是血栓趋势的形成，通常表现为心脏病发作、中风、深静脉血栓和急性冠状动脉综合征，例如心肌梗死和不稳定型心绞痛。此外，血栓可以引发栓塞，并造成肺栓塞或包括中风或短暂缺血性发作在内的脑血管栓塞。目前与凝血途径中的不平衡相关的病变的治疗方法存在很多风险，必须进行谨慎的控制。

肝素是一类具有抗凝性质的硫酸化的葡糖胺聚糖的名称。肝素在医学上广泛用作医用介入设备(invasive medical equipment)的涂层剂例如导管和植入体的涂层剂，以及治疗剂和预防剂。此外，已经将肝素与体外循环血液透析一起使用，作为化疗药物和抗炎药物的助剂，作为生长因子的调节剂，并且用于治疗血液动力学紊乱(haemodynamoic disorder)、先兆子痫(pre-eclampsia)、肠炎疾病(inflammator bowel disease)、癌症(cancer)、静脉血栓疾病(venous thromboembolic)、不稳定的冠脉局部缺血疾病(unstablecoronary ischemic disease)和急性脑血管局部缺血(acute cerebravascularischemia)。 肝素是天然的抗凝药物，广泛分布在哺乳动物的肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠黏膜、肌肉和血液中，多与蛋白质结合成复合物存在，这种复合物无抗凝活性，随着蛋白质去除而活性增加。各种组织中肝素的含量与肥大细胞的数目有关，肥大细胞内的颗粒含有肝素或肝素前体，当物理或化学的刺激使肥大细胞脱颗粒时，肝素被释放出来，在体内被肝素酶灭或而通过尿液排泄出去。 肝素具有聚合结构，因而肝素组合物通常包含分子量通常为5kDa至40kDa的肝素(例如参见Mulloy et al.，Thromb.Haemost.84：1052-1056(2000))。分子量范围如此广的肝素通常是指未分级肝素(unfractionated heparin，UFH)。

低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)是由未分级肝素经化学或酶解聚的方法得到的低相对分子量(Mr)的肝素片段或经分级得到的低Mr肝素组分，Mr范围一般为3000-8000，平均Mr为5000左右。低分子肝素的抗凝血酶FIIa活性远低于其抗Xa因子的活性。LMWH具有抗凝血、抗血栓、调血脂、抗肿瘤等作用，与UFH相比具有以下几个优点：它更好地被吸收，并且可以进行皮下给药；在血流中保留更长的时间；具有更可预测的临床响应；可能引起更少的与UFH有关的不利副作用例如出血过多、血小板数量偏低、骨质疏松和刺激注射部位。

低分子肝素可从肝素直接分离，或把肝素降解后再纯化得到。分离方法包括：有机溶剂分级沉淀法、凝胶色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法和超滤法等。这些方法保持了未分级肝素原有的结构特征和生物学活性，但由于低分子量的成分再UFH中的含量低，不宜于大规模生产。降解方法有肝素酶解法、亚硝酸降解法、过氧化氢降解法、过碘酸降解法、β-消除法、γ-照射法等。不同方法制备得到的LMWH之间结构差异最大之处在于其末端结构，由亚硝酸降解得到的产物，其末端具有无水甘露醇残基，β-消除法的产物具有非硫酸化或2-O-硫酸化的不饱和糖醛酸非还原末端。由于化学降解法反应的剧烈，使得肝素分子中的某些功能基团再反应过程中或多或少被破坏，从而对其某些生物学功能带来一定影响。而酶法降解由于其反应条件温和、便于检测以及生物活性保持较好等特点，成为近年来LMWH提取研究的热点。

现在商品肝素主要来源于牛肺、猪肺、猪肠黏膜和羊肺等动物器官。但是，由于认识到哺乳动物不同种属之间存在的属间交叉病毒和朊病毒感染，对源自哺乳动物的LMWH的使用所带来的副作用倍受关注。针对上述问题，本发明提供了一种使用极为广泛的非哺乳类鱼类资源，改进酶法提取工艺，获取高凝血活性低分子量肝素的制备方法。

 

发明内容