[发明专利]一种低分子量肝素的制备方法

权利要求书

1.一种制备低分子量肝素的方法，其具体步骤为：从鱼类组织中粗提获得未分级肝素组分，用肝素酶降解未分级肝素(UFH)，得到低分子量肝素冻干纯品，分析其分子量，并对其含量和活性进行测定。

2.如权利要求1所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，从鱼类组织中粗提获取未分级肝素组分的步骤为：在组织搅拌机中加入等量的鱼类组织和PBS缓冲液进行组织匀浆，将匀浆物中加入40％的NaOH调节pH到9.0，升温至80℃温育3小时，并以10000rpm离心，收集上清液备用；在上清液中加入50％硫酸铵进行盐析步骤，升温至80℃，搅拌1小时，8000 rpm离心，收集上清施加至强碱性阴离子交换树脂，并使用含有4M NaCl的PBS缓冲液对肝素进行洗脱；收集洗脱组分，使用截留分子量为1000Da的过滤器对洗脱液进行浓缩和脱盐，加入95％乙醇洗涤2-3次后进行真空冻干处理，即获得未分级肝素冻干品。

3.如权利要求2所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述的鱼类为海鱼，优选鲑鱼。

4.如权利要求2所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述鱼类组织选自头、皮、鳃和内脏。

5.如权利要求1－4任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，用肝素酶降解未分级肝素获得低分子量肝素的步骤包括：取UFH组分溶于pH7.4的PBS溶液中，充分溶解后离心去除杂质，在上清液中加入肝素酶III(EC 4.2.2.8)，37℃水浴反应10小时后，不加入相同量的肝素酶III，继续反应10小时，然后水浴升温加热至80℃，1小时候停止反应并10000rpm离心，收集上清液用0.22μm滤膜过滤，加入NaCl固体使其盐浓度未20％(wt)，然后加入90％乙醇，低温静置过夜，直至有沉淀析出，8000 rpm离心 20min后，弃去上清收集沉淀，重复上述盐析、脱水步骤，将获得的沉淀冻干处理后即得低分子量肝素纯品。

6.如权利要求1－5任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述低分子量肝素含量的测定的方法采用咔唑比色法。

7.如权利要求1－6任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述低分子量肝素纯度和分子量分析采用高效液相质谱联用仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳法，其中高效液相-质谱法的具体操作步骤为：将冻干纯品溶解于蒸馏水配制成1μg/μl的浓度，进样5μl，流动相A为水/乙腈(85:15 v/v)，B为水/乙腈(35:65 v/v)，两个流动相均含有12mM的三丁基氨TBA和38mM醋酸铵，pH用醋酸调节至6.5，梯度洗脱程序为0％B流动相洗脱10分钟，开始增加B的使用量，在60分钟内使得B在总流动相中的比例由0％匀速增加到100％，色谱柱为ZorbaxSB-C18(5μm，0.5×250mm)，洗脱速度为10μl/min，洗脱液直接接入电喷雾离子源质谱分析仪中，电喷雾接口设置为负电模式，进口电压为-40V，出口为-40V，离子源温度控制在325℃以使得最大程度的得到离子，全谱扫描宽度为150-1500Da，扫描速率为10次/秒，氮气分别被用作干燥气(5L/min)和中和气(20psi)，数据处理采用Data Analysis 2.0。

8.如权利要求1－7任一所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，对低分子量肝素活性的测定包括羊血浆法测定抗Ⅱa效价和生色底物法测定抗Ⅹa效价。

9.如权利要求8所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述羊血浆法测定抗Ⅱa效价的步骤为：取16支干净带塞糖管编号1至16置于37℃水浴中,按逐管递增10μl规律依次加入100μl到250μl的标准肝素(8IU/ml)，再按顺序加入羊血浆1 ml和0.25%的氯化钙0.8 ml,带塞倒转3次使混匀并湿润管内壁,勿产生气泡，置于水浴中恒温1 h后将其全部取出,观察各管的凝固程度,找出标准肝素的1/2凝固体积(标准肝素V1/2)，精确称取层析分离后的肝素寡糖冻干粉适量,用水溶解成1 mg/ml,测定时按估计效价用0.9%氯化钠稀释适当倍数，用上述方法测定各供试品的1/2凝固体积(供试品V1/2)，按如下公式计算各供试品的抗凝血酶效价:供试品效价(IU/mg)=(标准肝素V1/2/供试品V1/2)×标准肝素效价×稀释倍数。

10.如权利要求8所述的制备低分子量肝素的方法，其特征在于，所述生色底物法测定抗Ⅹa效价的步骤为：参照英国药典方法将对照品依诺肝素用Tris₂NaCl缓冲液(pH7.4)配制成4个具一定浓度梯度(0.02、0.08、0.14、0.2 Anti F Xa IU/ml)的溶液，精密称取肝素寡糖冻干粉适量,用上述缓冲液溶解成1 mg/ml,测定时再用缓冲液稀释适当倍数，ATⅢ和Xa因子均用上述缓冲液溶解按说明稀释成适宜浓度，生色底物加水溶解成3 mmol/L溶液,临用前再用Tris2EDTA缓冲液(pH8.4)稀释成0.5 mmol/L溶液，取干净具塞试管置于37℃水浴中,加入对照品或供试品溶液80μl,空白管中加入PH7.4的缓冲液80μl，再依次加入抗凝血酶Ⅲ溶液80μl,Xa因子溶液160μl,生色底物CBS溶液400μl,每次加试剂后都迅速漩涡振荡混匀,勿产生气泡,分别精确保温1 min、2 min和4 min，最后加入37%的醋酸600μl终止反应,在波长405 nm处测定吸收度，以对照品效价为横坐标,空白管减去对照管吸收值为纵坐标做标准曲线,根据供试品的吸收值差值在标曲上查出相应的效价值。