[发明专利]基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料和生物分析技术领域，尤其是涉及一种基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法。

背景技术

免疫分析技术因其独有的特异性，在临床诊断和环境检测等方面得到广泛地应用。酶联免疫分析技术(ELISA)自1971年建立以来，便由于其所具有的快速、灵敏、简便、易于标准化等优点，得到迅速的发展和应用，逐步成为应用最广泛的免疫分析方法之一，涉及免疫学检验的各个领域。但是，如果它所用到的蛋白酶的一些本质的缺点可以被克服，比如说蛋白酶容易失活、稳定性不高等，那么酶联免疫分析的性能将可能被进一步的提高。此外，提取和纯化蛋白酶往往是耗时、昂贵和复杂的；制备和纯化酶标记的抗体复合物也是非常复杂和昂贵的。因此，人们在努力地寻找天然蛋白酶的各类替代品（即人工模拟酶）用于免疫分析。纳米科学和纳米技术的出现，为人工模拟酶的发展开阔了新的视野。纳米材料由于它们具有比表面积大等优点使他们成为很吸引人的高效催化剂。到目前为止，很多纳米材料已经被发现具有模拟酶的催化活性。比如，四氧化三铁磁性纳米颗粒、带正电荷的金纳米颗粒、氧化石墨烯和单壁碳纳米管等已经被发现具有本质的类过氧化物酶活性。[J. Xie et al., TrAC Anal. Chem., 2012, 39: 114] 而且已经有文献报道一些纳米材料模拟酶可以替代天然蛋白酶应用于免疫分析，展现出优秀的稳定性。但是，目前这些纳米材料模拟酶催化活性还不够高，往往需要经过复杂的修饰才能标记到抗体上。这些不足导致了基于这些纳米材料模拟酶的免疫分析的灵敏度往往不够高、检测线不够低，使得其无法达到实际临床免疫学检测低丰度蛋白的需求。因此在模拟酶免疫分析中，催化活性高、稳定性好、易于标记生物分子的纳米材料模拟酶标记物的开发具有极其重要的意义。

在这些纳米材料模拟酶中，铂纳米颗粒因其著名的优秀催化性能成为关注的重点。依据已有的报道，铂纳米颗粒具有高效的类过氧化物酶活性，可以催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺显蓝色[M. Ma et al., Colloids Surf. A, 2011, 373: 6]。而且铂纳米颗粒易于与生物分子偶联，具有良好的生物相容性、水溶性和化学稳定性。在纳米生物检测领域中，铂纳米颗粒不仅可以作为信号载体放大检测信号，还可以作为标记物产生检测信号[J. Zhou et al., Biosens. Bioelectron. 2012, 35: 394] [J. Zhang et al., Biosens. Bioelectron. 2010, 26: 418]。因此，利用铂纳米颗粒作为过氧化物模拟酶代替辣根过氧化物酶进行比色免疫分析具有重大的实际意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析新方法，该分析方法主要用于血清中低丰度蛋白含量的检测。利用铂纳米颗粒模拟酶催化活性高、稳定性高、易于标记等特点，在对其进行抗体标记形成纳米探针复合物之后，可以建立一种无酶、高灵敏且性能稳定的免疫分析方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于铂纳米颗粒模拟酶的免疫分析方法包括如下步骤：

（1）制备铂纳米颗粒模拟酶；

（2）将铂纳米颗粒模拟酶标记到抗体上制成铂标抗体纳米探针；

（3）将已包被在酶标微孔板上的抗体、待测样品以及铂标抗体纳米探针通过夹心型免疫分析反应模式形成免疫复合物；将所述免疫复合物与游离的铂标抗体纳米探针进行分离。

（4）加入铂纳米颗粒模拟酶的最适底物液，用酶标仪检测各个微孔的吸光度值。再根据吸光度值的强弱用以定量待测样品。

步骤（1）和（2）所述的铂纳米颗粒模拟酶是通过硼氢化钠还原氯铂酸钾得到的；所述的铂纳米颗粒模拟酶粒径为3~5nm，其表面带负电荷。

步骤（2）所述铂纳米颗粒模拟酶与抗体的结合为正负电荷相吸作用结合、疏水作用结合和化学键作用结合。

步骤（3）所述酶标微孔板是高亲和力的96孔聚苯乙烯微孔板；所述待测样品为大分子目标物；所述夹心型免疫分析模式的完成采取两步法：即待测样品、已包被在酶标微孔板上的抗体混合发生免疫反应形成一种免疫复合物，在与铂标抗体纳米探针混合发生免疫反应形成免疫复合物。

步骤（4）所述铂纳米颗粒模拟酶的最适底物液为含有浓度为7.63M 的过氧化氢和浓度为0.921mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的柠檬酸钠-磷酸缓冲液（pH 4.0）。