[发明专利]哺乳动物的胚胎或受精卵的非冻结低温保存方法

说明书

本发明公开了一种与以往相比可以长期在非冻结状态下良好地保存哺乳动物的胚胎和受精卵、并且可以高度维持保存后的胚胎的孵化能力或受胎率的新手段。本发明的哺乳动物的胚胎或受精卵的保存方法包括：将哺乳动物的胚胎或受精卵浸在含有20～80%(V/V)的血清和10～100mM的Good’s缓冲液的培养基中，在非冻结低温下保存上述胚胎或受精卵。另外，本发明的哺乳动物的胚胎或受精卵的保存液本质上由含有20～80%(V/V)的血清和10～100mM的Good’s缓冲液的培养基构成。Good’s缓冲液优选为HEPES。

技术领域

本发明涉及在非冻结低温下保存哺乳动物的胚胎或受精卵的方法和保存液。

背景技术

仅在日本国内每年就有6万个以上的牛胚胎在流通。而且，在北美、南美、欧州以及亚洲地区牛胚胎的需求逐年增加。因此，全球都在进行关于牛胚胎冻结保存的研究，开发了多种缓慢冻结法或急速冻结法，得到了比较稳定的受胎率(受孕率)。但是，根据目前的技术水平，只能得到50%左右的受胎率，在此20年以前尚未报道进一步提高受胎率的大的改善对策。这也许暗示了：哺乳类胚胎的冻结保存方法达到了某种程度的技术极限。

另外，可以耐受冻结·融解损伤的胚胎仅限于高品质的胚胎，即使通过过剩排卵处理生产了多个胚胎，也会因各种要因(例如供卵牛的体质或供试精子的活力等)而只得到低品质胚胎，此类例子也非常多。但是，这些低品质胚胎如果经过冻结处理，也可以移植到受胎牛的子宫中生产小牛。

倘若有在短期内在非冻结状态下抑制由供卵牛回收的牛胚胎的发育同时使其继续存活的方法，则可以利用送货上门等的运输方法，将没有受到冻结·解冻所伴随的损伤的胚胎以极高的效率用于小牛生产。另外，当供卵牛与受卵牛的发情周期为数天时，可以根据受卵牛的发情周期调整移植时期。而且，如果开发了如上所述的胚胎保存方法，则认为不需要液氮或深度冷冻器等昂贵的冷冻设备。即，可以使用家庭用冰箱来保存胚胎。

迄今为止，有报道称：牛胚胎的非冻结保存以3天(非专利文献1)为限，羊胚胎的非冻结保存以4天(非专利文献2)为限。另外，据报道，Zoarces elongatus Kner(长绵鳚)这种鱼种所具有的热滞后蛋白(Nfe8)以及热滞后类似蛋白Nfe11和Nfe6在低温环境下发挥细胞延寿功能(专利文献1)，期待着作为细胞延寿剂的实用化。

作为非冻结低温胚胎保存对象来研究的动物种有小鼠、猪、绵羊、牛、稀有物种等，但每个动物种的胚胎性质大不相同。由此，胚胎保存中有效成分或它们的混合率、有效浓度范围也大不相同，每个动物种均需查明保存液成分。关于牛胚胎在非冻结低温下的保存方法，很久以来从受胎率的提高、供卵牛-受卵牛间的发情同期化问题和低品质胚胎的利用方面进行了研究，但尚未开发出有效的保存方法。

在这种状况下，期待着开发一种哺乳动物胚胎保存液，所述保存液在非冻结低温下更有效地保护或保存哺乳动物胚胎，不仅延长它们的寿命，还保持孵化能力或带来高受胎率。另外，还强烈希望开发哺乳动物胚胎的保存方法，所述保存方法可以在运输所需的天数内保存，并且还兼具实现用耗能少的通用性设备或容器进行保存或运输的条件。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2010-248160号公报；

非专利文献

非专利文献1：Lindner GM and Ellis DE. Refrigeration of bovine embryos.Theriogenology 1985; 23: 202.；