[发明专利]经修饰的级联核糖核蛋白及其用途

说明书

本发明涉及遗传工程领域，更具体地涉及生物体(包括原核生物和真核生物)的基因和/或基因组修饰领域。本发明还涉及制作在基因组分析和遗传修饰方法中使用(无论体内还是体外)的位点特异性工具的方法。本发明更具体地涉及以序列特异性方式识别并关联于核酸序列的核糖核蛋白的领域。

细菌和古细菌具有多种多样的针对侵入性DNA的防御机制。所谓的CRISPR/Cas防御系统通过将质粒和病毒DNA片段整合到宿主染色体上的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的基因座中来提供适应性免疫。病毒或质粒来源的序列，被称为间隔区，由重复的宿主来源的序列彼此隔开。这些重复元件是该免疫系统的遗传记忆，并且每个CRISPR基因座都含有在先前遇到外来遗传元件期间获得的独特“间隔区”序列的多样的所有组成成分(repertoire)。

外来DNA的获得是免疫的第一步，但是保护则需要将CRISPR转录，并且需要将这些长的转录物加工成短的CRISPR来源的RNA(crRNA)，这些CRISPR来源的RNA各自含有与外来核酸攻击物(challenger)互补的独特间隔区序列。

除了crRNA，在若干生物体中的遗传实验已表明，获得免疫力的步骤、crRNA生物发生和靶向干扰还需要一组独特的CRISPR相关(Cas)蛋白质。另外，来自在系统发生上不同的CRISPR系统的Cas蛋白亚组已被证明装配成包括crRNA的大复合物。

最近对CRISPR/Cas系统的多样性的重新评估导致分类为三种不同的类型(Makarova K.等人(2011)Nature Reviews Microbiology–AOP,2011年5月9日；doi:10.1038/nrmicro2577)，这些类型在cas基因含量上有所不同，并在整个CRISPR防御途径中显现出很大的差异。(本说明书中对CRISPR相关基因采用了Makarova分类和命名法。)CRISPR基因座的RNA转录物(前crRNA)在I型和III型系统中被CRISPR相关(Cas)内切核糖核酸酶或在II型系统中被RNAase III在重复序列上特异性切割；生成的crRNA被Cas蛋白复合物所利用，作为引导RNA来检测入侵DNA或RNA的互补序列。靶核酸的切割已在体外针对以尺子锚定机制(ruler-anchored mechanism)切割RNA的强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)III-B型系统得到证实，并且最近在体内针对在互补靶序列(原间隔区(protospacer))上切割DNA的嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)II型系统得到证实。相比之下，对I型系统而言，CRISPR干扰的机制仍然在很大程度上是未知的。

模式生物体大肠杆菌(Escherichia coli)菌株K12拥有CRISPR/Cas I-E型(之前被称为CRISPR E亚型(Cse))。它含有八个cas基因(cas1、cas2、cas3和cse1、cse2、cas7、cas5、cas6e)和下游CRISPR(2型重复)。在大肠杆菌K12中，这八个cas基因编码在CRISPR基因座的上游。Cas1和Cas2似乎不是靶向干扰所需要的，而很有可能参与新靶序列的获得。相比之下，六种Cas蛋白：Cse1、Cse2、Cas3、Cas7、Cas5和Cas6e(之前也分别被称为CasA、CasB、Cas3、CasC/Cse4、CasD和CasE/Cse3)对于针对λ噬菌体攻击的保护而言是必需的。这些蛋白质中的五种：Cse1、Cse2、Cas7、Cas5和Cas6e(之前分别被称为CasA、CasB、CasC/Cse4、CasD和CasE/Cse3)与crRNA一起装配以形成被称为级联(Cascade)的多亚基核糖核蛋白(RNP)。

在大肠杆菌中，级联(Cascade)是一种405kDa的核糖核蛋白复合物，其由化学计量不等的五种功能上必需的Cas蛋白Cse1₁Cse2₂Cas7₆Cas5₁Cas6e₁(即，按以前的命名法为CasA₁B₂C₆D₁E₁)以及61-nt CRISPR来源的RNA所组成。级联是专性RNP，其依赖于crRNA以供复合物装配和稳定性以及入侵核酸序列的鉴别。级联是一种监视复合物，其发现并结合与crRNA的间隔区序列互补的外来核酸。