[发明专利]经修饰的级联核糖核蛋白及其用途

权利要求书

1.一种用于抗病毒防御的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关复合物(级联)，该级联蛋白质复合物或其部分至少包含CRISPR相关蛋白质亚基：

-Cas7，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与之有至少18％同一性的序列，

-Cas5，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与之有至少17％同一性的序列，和

-Cas6，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与之有至少16％同一性的序列；

并且其中至少一个亚基包括提供核酸或染色质修饰、可视化、转录激活或转录抑制活性的额外的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的蛋白质复合物，其中所述Cas6亚基为Cas6e亚基，其具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与之有至少16％同一性的序列。

3.如权利要求1或权利要求2所述的蛋白质复合物，其进一步包含Cse2亚基，该Cse2亚基具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与之有至少20％同一性的序列；任选地，其中正是该Cse2亚基包括所述额外的氨基酸序列。

4.如权利要求1至3中的任一项所述的蛋白质复合物，其进一步包含Cse1亚基，该Cse1亚基具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与之有至少9％同一性的序列；任选地，其中正是该Cse1亚基包括所述额外的氨基酸序列。

5.如权利要求4所述的蛋白质复合物，其为I型CRISPR-Cas系统蛋白质复合物；优选为I-E亚型CRISPR-Cas蛋白质复合物。

6.如权利要求1至5中的任一项所述的蛋白质复合物，其中所述额外的氨基酸序列被翻译地融合或共价连接到所述至少一个亚基上；优选地，所述额外的氨基酸序列融合或连接到Cse1、Cse2、Cas7、Cas5、Cas6或Cas6e亚基中的至少一个的至少N末端和/或C末端。

7.如权利要求6所述的蛋白质复合物，其中所述额外的氨基酸序列融合或连接到Cse1、Cse2或Cas5亚基的N末端或C末端；优选Cse1亚基的N末端、Cse2亚基的N末端或Cas7亚基的N末端。

8.如权利要求7所述的蛋白质复合物，其中所述额外的氨基酸序列为蛋白质；任选地选自解旋酶、核酸酶、核酸酶-解旋酶(例如，Cas3)、DNA甲基转移酶(例如，Dam)或DNA脱甲基酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、乙酰化酶、脱乙酰酶、磷酸酶、激酶、转录(辅)激活物、RNA聚合酶亚基、转录阻抑物、DNA结合蛋白、DNA结构化蛋白、标志物蛋白、报道蛋白、荧光蛋白、配体结合蛋白(例如，mCherry或重金属结合蛋白)、信号肽(例如，Tat-信号序列)、亚细胞定位序列(例如，核定位序列)或抗体表位。

9.如权利要求8所述的蛋白质复合物，其中所述核酸酶选自II型限制性内切核酸酶；优选FokI；更优选经修饰的FokI，例如，KKR Sharkey或ELD Sharkey。

10.如任一前述权利要求所述的蛋白质复合物，其进一步包含RNA分子，该RNA分子包含与靶核酸序列有至少50％同一性的核糖核苷酸序列，并且其中所述蛋白质复合物和所述RNA分子形成核糖核蛋白复合物。

11.如权利要求10所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子的一部分与所述靶序列具有至少50％的同一性。

12.如权利要求11所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子的所述部分沿其长度与所述靶序列至少实质互补。

13.如权利要求10至12中的任一项所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子的所述长度在35-75个残基的范围内。

14.如权利要求10至13中的任一项所述的核糖核蛋白复合物，其中用于靶向期望的核酸序列的所述RNA分子的所述部分为32或33个残基长。

15.如权利要求10至14中的任一项所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子包含位于与所述靶序列有至少实质互补性的所述RNA序列的5'侧的8个残基。

16.如权利要求10至15中的任一项所述的核糖核蛋白复合物，其中所述RNA分子具有发夹和四核苷酸环形成序列，该序列位于与所述靶序列有至少实质互补性的所述RNA序列的3'侧。