[发明专利]葱叶凝集素重组蛋白、其编码多核苷酸、引物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种葱(Allium fistulosum)叶凝集素(AFAL)重组蛋白、其编码多核苷酸、引物，及其制备方法，所述葱叶凝集素(AFAL)蛋白具有杀虫活性和血细胞凝集活性。本发明尤其涉及对可应用于血细胞凝集和昆虫防治的葱叶凝集素(AFAL)的核酸序列(afal)编码。

背景技术

植物凝集素，也被称为“凝集素”，是糖结合蛋白的异质组(heterogeneous group)，其能够可逆地结合单糖和/或复合碳水化合物(Van Damme等人1998；CRC Crit Rev Plant Sci 17:575–692)。它们在分子结构、糖结合特异性和时空调节方面表现出明显的异质性。甘露糖结合凝集素广泛存在于高等植物中，由于其具有识别高甘露糖型聚糖的能力，因而能发挥显著的对微生物病原体和植物捕食者的防御作用(Van Damme等人1998,1998,CRC Crit Rev Plant Sci 17:575–692；Van Damme等人2004 Trends Plant Sci 9:484-9)。来自大蒜叶[大蒜(Allium sativum)叶凝集素(ASAL)]的甘露糖接合凝集素是25kDa同型二聚体蛋白，在结构上和进化上都与雪花莲(Galanthus nivalis)凝集素(GNA)相关(Smeets等人1997a,Plant Mol Biol 35:531–535；Van Damme等人1992,.Eur J Biochem 206:413–420)。ASAL的一些生物特性是-(1)它易于凝集兔红细胞，但不影响人体红细胞(Bandhopadhyay等人2001,Plant Sci.161:1025–1033；Smeets等人1997a,Plant Mol Biol 35:531–535；)，(2)它具有对MT-4细胞中逆转录病毒(HIV1和HIV2)诱导的细胞病变的抑制作用(Smeets等人1997b,Plant Mol Biol 33:223–234)，以及(3)它对同翅目(Homoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和鞘翅目(Coleoptera)一系列昆虫具有毒性(生长抑制性)。由ASAL抑制的一些重要的害虫有蚜虫[菜蚜(mustard aphid)，桃蚜(peach potato aphid)、烟蚜(tobacco aphid)(Bandhopadhyay等人2001,Plant Mol Biol 33:223–234 Hossain等人2006,Crop Sci 46:2022-2032；Smeets等人1997a,Plant Mol Biol 35:531–535)、棉红蝽(red cotton bug)(Bandhopadhyay等人2001,Plant.Mol.Biol.33:223–234)、褐飞虱(brown plant hopper)、大青叶蝉(green leaf hopper)(Saha等人2006,Plant Mol.Biol.62:735-52)和衣蛾(cotton leaf worm)(Sadeghi et al.2008,Transgenic Res.17:9-18)。虽然对凝集素的杀虫作用的确切机制尚未完全了解，但是已提出了三种不同的作用方式-(1)该凝集素与中肠的围食膜(peritrophic matrix)结合，抑制营养的吸收(Harper等人1998,Tissue Cell 30:166–176)，(2)与中肠的上皮细胞上的糖蛋白结合并破坏组织的完整性(Powell等人1998,J Insect Physiol.44:529–539；Sauvion等人2004,J Insect Physiol.50:1137–1150)，以及(3)与昆虫口部的感觉感受器的碳水化合物部分结合，破坏膜的完整性并干扰昆虫的食物检测能力(Murdock等人2002,J Agric Food Chem.50:6605–6611)。所有这些机制导致昆虫摄取食物或吸收营养物质的能力降低，从而导致发育迟缓和过早死亡。

美国专利5,545,820(Gatehouse,等人,1996)公开了衍生自石蒜科(Amaryllidaceae)或葱科(Alliaceae)的具有特异性甘露糖结合能力的凝集素在防治害虫中的应用。WO/1992/002139涉及衍生自石蒜科或葱科(Alliaceae)的具有特异性甘露糖结合能力的凝集素在防治害虫中的用用以及表达这类凝集素的转基因植物的培植。美国专利5407454涉及对许多常见农作物害虫具有杀蚴活性的精选植物凝集素。转基因植物的抗虫性是由于在植物所有细胞中插入了杀蚴凝集素基因。