[发明专利]葱叶凝集素重组蛋白、其编码多核苷酸、引物及其制备方法

权利要求书

1.一组用于扩增Seq ID No 1的葱叶凝集素(afal)基因的基因特异性引物GSP 1和GSP 2，其特征在于，所述引物分别具有如下所示的Seq ID No.5和Seq ID No.6的序列：

GSP1(5’-ATGGACAGTACTCCATCTCCTAAAC-3’)

GSP2(5’-TTAGCCCCTTGGCCTCCTGCA-3’)。

2.一组用于扩增由Seq ID No 2表示的成熟afal基因的基因特异性引物GSP 3和GSP 4，其特征在于，所述引物分别具有如下所示的Seq ID No.7和Seq ID No.8的序列：

GSP 3(5’-AGAAACGTATTGGTGAACAACG-3’)

GSP 4(5’-TTATCTTCTGTAGGTACCAGTAGAC-3’)。

3.一种通过使用权利要求1和2所述的引物扩增AFAL基因来制备葱叶凝集素(AFAL)重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)从所述葱叶中提取总RNA，

b)由从所述葱叶中提取的总RNA合成cDNA，

c)由cDNA的5’-和3’-RACE片段设计引物GSP1和GSP2，以克隆全长蛋白编码DNA，设计引物GSP3和GSP4用于克隆编码AFAL蛋白的成熟多肽的DNA，

d)在大肠杆菌SUMO表达载体中表达编码成熟AFAL的DNA，其中SUMO肽在N-末端与AFAL融合并通过T7启动子在大肠杆菌中表达，从而得到所需的AFAL重组蛋白。

4.由Seq ID No 1表示的核酸序列，其通过权利要求1和3所述的方法得到，其特征在于，Seq ID No 1包括1至585个核苷酸或与其互补的序列，用于编码全长葱叶凝集素多肽，其中核苷酸序列583-585是终止密码子。

5.由Seq ID No 2表示的核酸序列，其使用权利要求1-4所述的全长AFAL编码基因作为模板，利用引物GSP3和GSP 4进行PCR扩增得到，其特征在于，Seq ID 2是Seq ID 1的一部分，具有85至414核苷酸序列。

6.Seq ID No 3的多肽，其通过权利要求1-5所述的核酸Seq ID No 1编码，其特征在于，所述多肽是长度为194个氨基酸残基的葱叶凝集素(AFAL)蛋白前体。

7.Seq ID No 4的多肽，其通过权利要求5所述的核酸Seq ID No 2编码，其特征在于，所述多肽是长度为110个氨基酸残基的葱叶凝集素(AFAL)重组蛋白成熟肽，分子量为～12kDa。

8.根据权利要求7所述的重组蛋白，其特征在于，所述多肽的最小血细胞凝集素值在8μg/ml的范围内。

9.根据权利要求7所述的重组蛋白，其特征在于，所述蛋白表现出杀虫活性、杀真菌活性、杀细菌活性和抗增殖活性。

10.根据权利要求7所述的重组蛋白，其特征在于，所述蛋白对棉蚜、烟粉虱、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和斜纹夜蛾(Spodoptera litura)或任何其他作物昆虫，例如鳞翅目昆虫、同翅目昆虫、鞘翅目昆虫、双翅目昆虫及其他昆虫表现出杀虫活性。

11.根据权利要求7所述的重组蛋白，其特征在于，所述蛋白在大肠杆菌中表达，并可在任何表达系统中表达，例如假单胞菌属(Pseudomonas)，或在酵母表达系统中表达，例如人毕赤酵母(Pichia pestoris)或其他酵母。

12.基本如文中参照实施例和说明书附图所述的葱叶凝集素(AFAL)重组蛋白、其编码多核苷酸、引物，及其制备方法。