[发明专利]用于降低重组蛋白的降解的方法和材料

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2011年12月30日提交的美国临时申请流水号61/581,859的优先权权益，其内容通过提及完整并入本文。

发明领域

本发明涉及用于降低真菌细胞中的重组蛋白降解的方法和材料，更具体而言，涉及具有两种不同yapsin肽酶活性缺陷的遗传工程化耶氏酵母细胞。

发明背景

需要高效表达系统来生产目前开发下的大多数生物药物(例如，重组蛋白)。基于酵母的表达系统组合易于遗传操作与具有分泌并修饰蛋白质的能力的微生物生物体的发酵。然而，重组蛋白经常被胞内蛋白酶及胞外蛋白酶降解。如此，需要具有降低的重组蛋白降解的基于酵母的表达系统。

发明概述

本文件至少部分基于如下的发现，即重组蛋白的降解在具有两种不同yapsin肽酶活性YPS1蛋白(pYPS1)和YPS2蛋白(pYPS2)缺陷的耶氏酵母细胞中降低。本文中描述的遗传工程化耶氏酵母菌株可用于生成未降解的重组蛋白(例如抗体)。

在一个方面，本文件特征在于一种分离的耶氏酵母(Yarrowia)细胞(例如解脂耶氏酵母细胞)，其遗传工程化改造为包含pYPS1活性缺陷和pYPS2活性缺陷。在一些实施方案中，所述细胞不生成可检测水平的功能性pYPS1或功能性pYPS2。在一些实施方案中，所述细胞不生成可检测的编码功能性pYPS1和功能性pYPS2的mRNA分子。在一些实施方案中，所述YPS1和YPS2基因在所述细胞中被破坏。在一些实施方案中，所述YPS1和YPS2可读框被删除。

在另一个方面，本文件特征在于解脂耶氏酵母细胞的基本上纯的培养物，大量的所述解脂耶氏酵母细胞被遗传工程化改造为包含pYPS1活性缺陷和pYPS2活性缺陷。

本文件特征还在于一种用于降低耶氏酵母中生成的靶蛋白的降解的方法。所述方法包括在本文中描述的耶氏酵母细胞中表达编码所述靶蛋白的核酸。

在另一个方面，本文件特征在于一种用于生成靶蛋白的方法。所述方法包括提供遗传工程化改造为包含pYPS1活性缺陷，pYPS2活性缺陷，和编码所述靶蛋白的核酸的耶氏酵母细胞；并b)在使得所述细胞生成所述靶蛋白的条件下培养所述细胞。

本文中描述的任何细胞可以进一步是OCH1活性缺陷的。

本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码alpha-1,2甘露糖苷酶的核酸。alpha-1,2甘露糖苷酶可以包含靶向序列以将所述alpha-1,2甘露糖苷酶靶向至胞内区室。

本文中描述的任何细胞可以进一步是ALG3活性缺陷的。

本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码alpha-1,3-葡萄糖基转移酶的核酸。

本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码葡糖苷酶的alpha和beta亚基的核酸。

本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码GlcNAc-转移酶I的核酸。GlcNAc-转移酶I可以包含靶向序列以将所述GlcNAc-转移酶I靶向至胞内区室。

本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码GlcNAc-转移酶II的核酸。GlcNAc-转移酶II可以包含靶向序列以将所述GlcNAc-转移酶II靶向至胞内区室。

本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码半乳糖基转移酶的核酸。半乳糖基转移酶可以包含靶向序列以将所述半乳糖基转移酶靶向至高尔基体。

本文中描述的任何细胞可以进一步包含编码靶蛋白(例如溶酶体蛋白、病原体蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段的一条或两条多肽链、或融合蛋白)的核酸。所述抗体可以选自下组：结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体、结合表皮生长因子受体(EGFR)的抗体、结合CD3的抗体、结合肿瘤坏死因子(TNF)的抗体、结合TNF受体的抗体、结合CD20的抗体、结合糖蛋白IIa/IIb受体的抗体、结合IL2受体的抗体、结合CD52的抗体、结合CD11a的抗体、和结合HER2的抗体。所述抗原结合片段可以选自下组：Fab、F(ab’)₂、Fv、和单链Fv(scFv)片段。