[发明专利]制备人类原代肝细胞的球体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备人类原代肝细胞的球体的方法。所述方法包括：在允许肝细胞球体形成的条件下，在多糖支架上培养分离的人类原代肝细胞，以及随后使多糖支架溶解以释放肝细胞球体。通过本发明的方法得到的球体尤其适用于被移植到经受肝脏疾病折磨的受试者中。

背景技术

对于基于肝脏的代谢性障碍或肝功能衰竭，原位肝脏移植是最实用的根治疗法。但由于器官短缺，因此强烈需要发展一种维持或恢复正常肝脏功能的替代疗法。有趣的是，仅有少量(5％至10％)移植的肝脏组织就能够提供足够的功能来消除代谢性肝脏缺陷，并且甚至在患肝脏衰竭的患者中仅需要肝重量的1％至5％来进行再生(Puppi等人.(2009),Methods Mol Biol 481,1；Pietrosi等人.(2009),World J Gastroenterol 15,2074)。

本领域中，已经设想使用单细胞悬浮液进行肝脏细胞移植，并且该方法已经用于来自不同中心的超过80个的病例报告中(Fitzpatrick等人.(2009),J Intern Med 266,339)。遗憾的是，由于低细胞植入率，在大多数肝脏疾病中仅得到有限的成功。来自大鼠模型的数据证实：在大多数移植方法中，仅移植肝细胞的0.5％最终植入到受体肝脏中，并且将移植肝细胞长期植入到人类中是比较鲜为人知的(Allen等人(2001)J Lab Clin Med 138,298)。在患有雷弗素姆氏病(Refsum's disease)的婴儿的情况中，单肝细胞经八次门静脉输注仅产生不高于0.25％的植入(Sokal等人(2003),Transplantation 76,735)。涉及受体肝脏中低植入率和再生率的问题体现了在人类中通过肝细胞移植来成功治疗肝脏疾病的主要障碍。

三维(3D)支架的移植是另一种替代方式。在本领域中已经设想使用该方式来克服在单细胞悬浮液移植方法中所观察到的低细胞植入率。在3D支架的移植中，在该3D支架上已经培养了肝细胞。该3D支架的移植方法是基于如下的假设：由于改进的稳定性和耐应力性，三维的肝脏微组织更有可能植入到病变的肝脏组织中。例如，聚(L-乳酸)(PLLA)聚合物已经作为支架用于肝组织工程中(Torok等人.(2011)Liver Transpl.17,104-114)。这些支架被移植到受体中，并且在移植后的一段时间内被缓慢地降解。然而，已知基于支架的移植经常与被移植肝细胞的供血不足相关，而且也与不良的胆汁去除相关。

因此，需要一种用于根治肝脏障碍或肝脏衰竭的新的治疗方法。本发明提供了一种用于将分离的人类肝细胞，优选人类原代肝细胞培养成三维肝脏微组织的方法。这些肝脏微组织(通常被称作肝细胞球体)尤其适用于被植入到受体的病变肝脏组织和/或功能障碍的肝脏组织中。本发明的方法提供了分离的肝细胞球体，该分离的肝细胞球体没有任何诸如PLLA聚合物的人造支架或承载物。根据本发明的方法，肝细胞培养在多糖支架上，该多糖支架在球体形成之后被溶解。在溶解多糖支架之后，能够收获完整的肝细胞球体以用于后续的体内或体外应用，例如用于毒性研究或被移植到受体中。这样，本发明的方法克服了已经报道的与单细胞输注和基质植入相关的缺点。分离的球体与高细胞植入率以及快速整合到受体肝脏组织中相关，从而在消除代谢性肝脏缺陷和暴发性肝脏衰竭中提供了实质性帮助。

发明内容

本发明提供了一种用于制备尤其适用于移植医学中的人类肝细胞的三维聚集体，优选人类原代肝细胞的三维聚集体的方法。

因此，在第一方面中，本发明提供了一种用于制备培养的人类原代肝细胞球体的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在允许肝细胞球体形成的条件下，在多糖支架上培养人类原代肝细胞；

(b)使所述多糖支架溶解以释放所述肝细胞球体；

(c)使所述肝细胞球体与培养基分离。