[发明专利]用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法

说明书

本发明涉及用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法，以及用于执行所述方法的试剂盒。

用诸如单克隆抗体(mAb)的结合剂将白细胞染色是在基础研究以及多种诊断应用中常规执行的重要任务。例如通常必须对白细胞的细胞外以及细胞内标记物进行染色，以便通过特定细胞外表面标记物识别白细胞的特殊亚群，以及通过存在于细胞质中的特定分子识别所述细胞的功能特性。

为了用如mAb在细胞内将白细胞染色并使得它们可通过流式细胞术进行分析，有必要将白细胞透化并将存在于样品中的血红细胞裂解，同时使位于结合剂应当结合至的细胞表面和细胞内部两者处的白细胞的结构维持天然状态。该目标通常通过使用洗涤剂和/或醇类而实现。在使用如甲醛或醇类的固定步骤之后，血红细胞对洗涤剂的抵抗性较白细胞弱，从而允许血红细胞裂解并对透化的白细胞进行分析。

对白细胞进行细胞外染色和细胞内染色的多种方法基于相同的原理。具体地讲，首先将细胞的表面标记物染色，接着进行一个或多个洗涤步骤(即将细胞离心，弃去上清液，然后将它们重悬于新鲜的缓冲液中)，以便移除任何未结合的结合剂。然后将细胞固定，再次进行一个或多个洗涤步骤以移除固定剂，将细胞透化，再次洗涤，随后用细胞内结合剂进行染色，最后再次洗涤。

然而，这些工序不仅耗时(总持续时间最长至2到3小时)，而且十分耗费劳动力。此外，存在至少两个强制离心步骤，使得工序的自动化几乎不可能。此外，离心可能对细胞的结构不利，从而与未经离心的细胞相比，细胞的光散射信号变差。另外，离心始终导致细胞损失和细胞成团。最后，细胞外结合剂和细胞内结合剂必须独立地使用和施加，从而阻止了方便地使用结合剂混合物(cocktail)。

因此，本发明相关的技术问题是提供用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的改进方法，该方法快速且不那么耗费劳动力，避免了任何离心步骤，允许使用结合剂混合物，并且能够轻松地自动化。

上述技术问题的解决方案通过权利要求中表征的实施例实现。

具体地讲，本发明涉及用于标记白细胞的细胞内靶标和细胞外靶标的方法，该方法包括以下步骤：

(a)形成以下物质的组合：

(i)细胞组合物，所述细胞组合物包含至少白细胞和血红细胞，以及

(ii)第一溶液，所述第一溶液包含能够交联所述白细胞的细胞内蛋白、脂蛋白和核酸的一种或多种试剂；

(b)将第二溶液添加到所述组合中，所述第二溶液包含能够透化所述白细胞、裂解所述血红细胞并中和所述第一溶液中的所述一种或多种试剂的交联活性的一种或多种试剂，

其特征在于，所述第二溶液的添加体积介于所述组合的总体积的1倍和10倍之间；

(c)在添加所述第二溶液的同时或在添加所述第二溶液之后添加特异性地结合到白细胞的细胞外靶标上的至少一种结合剂，以及特异性地结合到白细胞的细胞内靶标上的至少一种结合剂，

其中所述结合剂中的每一种包括可检测试剂；以及

(d)将第三溶液添加到所述组合中，其中所述第三溶液的添加体积等于或大于所述第三溶液添加到其中的所述组合的总体积。

在一些情况下，本发明的方法在本文中被称为INCA法(细胞内无离心测定法)。

在一个实施例中，含有待染色的白细胞的细胞组合物是在悬浮液中含有细胞的生物流体。在另一个实施例中，细胞组合物选自全血、骨髓、腹膜液、脑液、分离的淋巴结和其他分离的组织。在更进一步的实施例中，细胞组合物为全血。

根据一个实施例，在本发明方法的步骤(b)之前，将在步骤(a)中获得的组合温育5至20分钟，在另一个实施例中，温育10至15分钟。根据一个实施例，步骤(a)中使用的能够交联白细胞的细胞内蛋白、脂蛋白和核酸的一种或多种试剂选自甲醛、低聚甲醛和戊二醛。在一个实施例中，在添加第一溶液之后，所述一种或多种试剂以0.5％至2％(v/v)的量包含在所述组合中，并且以介于5％和15％(v/v)之间的量包含在所述第一溶液中。在这个语境中，应当指出的是，执行本发明方法的步骤(a)是为了将包含在细胞组合物中的细胞固定。