[发明专利]表征组合物中的RNA的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、诊断且更特别是表达谱的领域。

背景技术

近几年来，在转录组分析领域中的研究已经从使用RNA印迹(Northern blotting)的以候选基因为基础的RNA检测发展成为由微阵列的出现驱使的高通量表达谱。自2006年，通过为细胞转录组的多维检验提供机会，新一代的测序技术已经使转录组学发生了巨大变化，在所述多维检验中，在单碱基分辨率下获得高通量表达数据。表1汇总基因表达谱里程碑。

表1.转录分析的里程碑

通过新一代测序已经开发了用于mRNA-seq的许多实验方案和商业试剂盒。通常，标准转录组分析的流程图包括11个步骤(步骤的编号和顺序对于某几个实验方案和平台可能略微不同。基于RNA连接的用于小RNA-seq的库(library)实验方案遵循不同的工艺流程且在此没有考虑)：

(1)分离总RNA；

(2)rRNA贫化和/或mRNA富集；

(3)片段化和尺寸选择

(4)通过逆转录酶反应合成cDNA

(5)第二链DNA合成

(6)末端-修复

(7)衔接子连接

(8)片段库的PCR富集

(9)产生集群(cluster)以便随后测序(例如，emPCR或桥扩增)

(10)测序；和

(11)数据分析。

mRNA的富集和/或rRNA的贫化是以最小冗余进行成功的cDNA库产生和测序的关键步骤，因为总RNA的大部分由rRNA分子组成。

对于复杂生物体如人类的全转录组谱，无疑将产生许多测序读数。基于在用于人类转录组的Illumina测序平台上得出的实验数据，表2给出用于不同分析目的的所需读数数目和测序策略的概述。

表2.用于具有复杂基因组的生物体如人类的转录组谱所需要的新一代测序读数的数目

在新一代测序平台上进行大规模平行测序的巨大能力和在基因组领域的全球努力已经使得我们关于人类基因组及其表达谱的认识得到极大改善。因此，我们预期包括剪接变体的几乎所有的转录体将在仅仅几年内发现。

然而，复杂转录组的全面分析仍然将是昂贵且劳动密集的，其包括生物和医学相关信息的数据分析和提取。

另外，从RNA提取到测序的许多工作步骤费时、易于出错且使得对比研究困难。最后，许多NGS机器不具有在一次测序操作内产生用于整个复杂转录组的足够读数的能力。

本发明在该领域中完成以下改善，其通过减少工作步骤数目在NGS机器上引起用于RNA测序的样品制备的显著改善，不需要mRNA富集/纯化、rRNA贫化。不需要衔接子连接。所述方法现在通过靶标基因表达谱(基因板定向测定(gene panel oriented assays))解决了具有有限测序能力的NGS机器的问题，所述方法通过进行索引(indexing)、分析基因表达水平、对已知(实施例1和2)和未知(实施例3)剪接位点变体进行也包括它们的定量的分析，能够实现多通路分析，所述定量分析包括单碱基分辨率且因此包括SNP检测(参见实施例3)。所述方法提供大数字动态范围。

另外，与US7,361,488形成对比，不需要载体且更重要的是确定体内RNA的序列，而不是检测杂交的寡核苷酸。该差异相当重要。

定义

“组合物”在本文中是包含至少一种或多种核糖核酸分子的水性溶液。

“带有3’-尾部的第一核酸分子，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交”为具有两部分的寡核苷酸，第一部分能够在其RNA靶标存在于所述组合物中时与其(特异性地)结合，且第二部分不与所述组合物中的RNA结合。

“带有5’-尾部的第二核酸分子，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交”为具有两部分的寡核苷酸，第一部分能够在其RNA靶标存在于所述组合物中时与其(特异性地)结合，且第二部分不与所述组合物中的RNA结合。

发明内容

本发明涉及在确定组合物中核糖核酸的序列和/或量的方法中确定核糖核酸的序列和/或量的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供包含一种或多种核糖核酸分子(RNA)的组合物，

(ii)使一种或多种两部分核酸杂交探针与所述一种或多种RNA杂交，其中各探针包括：

(a)带有3’-尾部的第一核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，