[发明专利]表征组合物中的RNA的方法和试剂盒

权利要求书

1.确定组合物中核糖核酸的序列和/或量的方法，所述方法包括以下步骤：

i.提供包含一种或多种核糖核酸分子(RNA)的组合物，

ii.使一种或多种两部分核酸杂交探针与所述一种或多种RNA杂交，其中各探针包括：

a.带有3’-尾部的第一核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，

b.带有5’-尾部的第二核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，

c.其中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与所述靶RNA杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此隔开2～1000个核苷酸，

iii.将杂交的第一核酸分子共价链接到杂交的第二核酸，其中所述链接通过逆转录和随后的连接反应完成，

iv.用对所述第一核酸分子的所述第一3’-尾部和所述第二核酸分子的所述第二5’-尾部具有特异性的引物扩增链接的分子，

v.对扩增产物进行测序，其中，在扩增步骤(iv)之前，

vi.分离步骤(iii)的链接的分子与靶RNA的杂合体，所述分离通过特异性针对DNA/RNA杂合体的抗体来捕集所述杂合体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增步骤(iv)之前，所述RNA被酶消化。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的尾部为10～50个核苷酸。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子包括经确定并不结合靶RNA的额外条形码序列，且其中所述序列的长度为3～20。

5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子对选自人类核酸序列、病毒序列、细菌序列、动物序列和植物序列的核酸序列具有特异性。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述序列为mRNA序列、外显子-外显子连接区和/或5’和3’UTR区。

7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其中应用的新一代测序方法选自：合成测序、焦磷酸测序、Sanger测序、寡核苷酸连接测序、半导体技术或单分子实时(SMRT^TM)测序。

8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其中带有3’-尾部的所述第一核酸分子和带有5’-尾部的所述第二核酸分子的浓度为1fM～1000nM，其中所述3’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交且所述5’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交。

9.试剂盒，其包含：

i.带有3’-尾部的第一核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与组合物中的RNA杂交，

ii.带有5’-尾部的第二核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与组合物中的RNA杂交，其中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与所述靶RNA杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此隔开2～1000个核苷酸，

iii.对RNA/DNA双链杂交分子具有特异性的抗体，和

iv.逆转录酶和/或DNA连接酶。