[发明专利]细胞分离方法

说明书

发明领域

本发明一般地涉及免疫学领域，特别涉及用于细胞分离的方法和组合物。

发明背景

细胞分离方法被广泛用在进行研究、诊断或临床应用的科学和临床实验室中。细胞分离的大多数策略是基于不同的物理性质，例如大小和密度。

通常在处理目标细胞(白细胞)之前必需除去红细胞。这可以通过使用例如，梯度密度离心法、外周血单核细胞(PBMC)样品制备或通过红细胞裂解(其全部是本领域公知的)分离细胞而通过其他方法来实现。

在除去红细胞后，利用与识别细胞上的表面抗原的抗原结合部分结合的固相颗粒进行的方法可用于将白细胞分离成亚群。这类方法可以用磁珠(例如，来自Miltenyi Biotec GmbH,Germany的基于柱的MACS技术；US5411863、US5543289、US6020210、US6417011；或非基于柱的：Life Technologies,Carlsbad,California)或不用磁珠进行，例如，利用高密度珠(US6730230、US5576185、US6900029、US6004743)进行，其利用致密珠的重力沉降来从生物样品分离所需的或不需要的细胞群体。

有几种方法允许直接从全血中正向选择细胞，如使用全血微珠与MACS技术(Miltenyi Biotec GmbH,Germany)。但这些方法仅限于少量的细胞。

当非离子聚合物如多糖和合成聚合物在体内输注或在体外添加到红细胞在缓冲液或血浆中的悬浮液中时促进红血细胞(即红细胞)聚集。诱导人红细胞聚集的聚合物的例子是分子量60,000-500,000的葡聚糖、分子量360,000的聚乙烯吡咯烷酮和分子量20,000的聚氧乙烯(POE)。

如果将抗凝的血液静置在管中，红细胞在白血细胞之前沉降且白细胞富集的血浆层可以在1个半小时或更长时间后分离。由于红细胞凝集的自发倾向，红细胞沉降比白细胞更迅速。有可能通过添加之前提及的聚合试剂(Skoog和Beck,1956,Blood,11:436)之一来加速红细胞的沉降。

密度梯度离心是允许细胞根据它们的大小、形状和密度分离的技术。密度梯度是在离心管中通过不同密度的溶液分层建立的，使得致密端在管的底部。细胞通常在浅的蔗糖或其他惰性碳水化合物梯度上分离，甚至在相对低的离心速度下分离。

不连续密度梯度离心通常用于将外周血单核细胞与粒细胞和红细胞分离。例如在所谓的Ficoll密度分离中，全血在FICOLL-上分层，然后离心。红细胞、粒细胞和约50％的单核细胞沉降到细胞沉淀物，而其余50％的单核细胞沉降到Ficoll血浆界面。所有的密度分离技术具有相同的基本限制：它们不能分离具有重叠密度分布的细胞亚群如淋巴细胞亚集，且它们包括费时和费力的离心步骤。

具有对细胞表面抗原的亲和力的单克隆抗体被用于在密度梯度离心后进一步分离特定的细胞。抗体特异性技术和密度梯度离心技术可同时使用。一些公开出版物(US5,840,502、US5,648,223、US5,646,004、US5,474,687和US7,316,932)描述了使用不连续密度梯度分离通过选择性地靶向和沉淀(pelleting)所需的/不需要的细胞类型而将致密颗粒用于正向或反向选择。

WO00/73794公开了一种利用免疫玫瑰花结(immunorosette)分离细胞的方法。该方法包括将含有有核细胞和红细胞的样品与抗体组合物相接触，这使得有核细胞和红细胞形成免疫玫瑰花结。该抗体组合物包含双功能抗体或四聚体抗体复合物。这里的概念是(1)将样品与抗体组合物在允许有核细胞和红细胞形成免疫玫瑰花结的条件下相接触，其中抗体组合物包含(a)至少一种结合待分离的有核细胞上的抗原的抗体，其连接于(b)至少一种结合红细胞的抗体，和(2)通过离心从样品中除去免疫玫瑰花结。优选地，红细胞特异性的抗体是抗血型糖蛋白A。在出版的Stem Cell Technologies手册中描述了使用Ficoll在具有和没有羟乙基淀粉(Hetastarch)的情况下的免疫玫瑰花结方案。这种方法的缺点是，它包括费时和费力的离心步骤。