[发明专利]用于通用实时多重分析检测的双功能寡核苷酸探针

说明书

本发明涉及一种包括探针区域和介质区域的介质探针。进一步，本发明涉及一种包括介质探针和检测分子的系统，该系统的用途以及用于检测至少一种靶分子的方法。

技术领域

本发明涉及一种包括探针区域和介质区域的介质探针。进一步，本发明涉及一种包括介质探针和检测分子的系统、该系统的用途以及检测至少一种靶分子的方法。

背景技术

现有技术中已经记载了样品的分子生物学检测和光学分析的大量研究方法。这些方法中的其中一种，是利用微阵列在少量生物样品材料中进行检测或进行几千种单独检测的平行分析。微阵列有各种形式，有时也称作“基因芯片”或生物芯片，类似于计算机芯片，其在非常小的空间内包含了大量的信息。

微阵列使得能够在通常为二维的基质上对各种分析物进行高度平行的检测。微阵列的固定探针分子在生产过程中在适当的基质上，通过少量液体的转运而被固定和/或合成在栅格(阵列)上的确定位置(点)。可以设计捕捉分子的这种二维、空间溶解的固定化，从而能够检测到核酸或肽和/或蛋白质。作为规则，原位复制(lithography)方法仅允许短寡核苷酸和/或氨基酸链的合成。所生产的DNA微阵列可以在适当的条件下保存数月，但蛋白质阵列仅能短时间保存。

对于微阵列分析，待分析样品与合适的缓冲液混合并与相应的微阵列一起孵育，于是，通常与互补序列片段发生杂交事件。基于微阵列系统的低敏感性，当要检测核酸(例如通过聚合酶链反应(PCR)、RT-PCR或全基因组扩增(WGA))的情况下，样品在先前的反应步骤中扩增，并且被用于检测的荧光染料标记，或例如与微阵列上额外的检测探针一起孵育。肽和蛋白质不能酶促扩增，通过样品的纯化而被浓缩用于分析。另一方面，还有一些方法，例如在成功杂交后通过滚环扩增(RCA)在微阵列上进行信号扩增。这种过程包括几个耗时的步骤，并且提高了不准确和污染的风险。通常的应用方式包括表达分析以及病原体或抗性标记的检测中的微阵列。对于本领域技术人员来说，在现有技术中能够看到对各种合成技术和应用的概览。

在现有技术中，描述了扩增的DNA片段在固定化的等位基因特异性寡核苷酸上的杂交，并且认为本领域技术人员能够获得常规方法中的一种。在各种浓度下利用引物分子的前述的扩增步骤使得能够产生单链标记的DNA，其优选地与待产生的微阵列的捕捉分子相互作用。将培养基转移到微阵列后，可以在成功杂交后利用荧光或通过使用标记生物素的引物直接进行检测，从而在杂交步骤以后接着进行孵育，特别是与链酶亲和素修饰的辣根过氧化物酶一起孵育，将可溶的物质转化为不可溶的反应产物。通过检测显色沉淀物，可以检测靶分子与捕捉分子之间的结合事件。固定化引物的延长反应可选地在预先扩增的靶序列的杂交之后进行，其中结合了标记生物素的核苷酸。在与链酶亲和素修饰的碱性磷酸酶一起孵育以及在添加适当的基质后，可以通过形成显色反应产物来检测靶序列的存在。

在另一实施方式(基于多重定量DNA阵列的PCR、MQDA-PCR)中，待检测的核酸首先与双功能引物平行地扩增，进行几个PCR循环。这会产生具有通用5’端的扩增产物，使得接下来能够进行与通用引物的竞争性准单倍体(quasi-monoplex)扩增。接着，在分离步骤中，靶序列特异性的探针通过添加修饰的核苷酸而被标记并且在微阵列上杂交。通过使用双功能引物，可以进行多重等级提高的两步PCR反应，并且不同序列不会对反应效率带来显著影响。这种复杂的程序方案对于整合成为工作程序具有消极影响。重复添加和除去反应物和/或反应产物并且在多容器之间转移反应批次物，会导致大量的手动工作量(“动手时间(hands-on time)”)、长等待时间(“等待结果的时间”)以及程序错误的风险。除了准备单个PCR反应批次物之外，程序包括多个孵育步骤，其中将双功能引物消解，例如探针被标记并且在微阵列上孵育。这导致待测靶序列与芯片表面上的固定化的捕捉分子之间的直接关联。因此，这种方法不适于在不产生新的微阵列的情况下区分靶序列。这些方法的另一缺点是扩增以后必须将样品材料在两个反应器皿之间转移，而在这个过程中可能产生程序错误和污染。