[发明专利]性能增强和温度抗性蛋白酶变体

说明书

本发明是酶技术领域。本发明特别涉及蛋白酶及其制备，其氨基酸序列已经修饰，特别是针对洗涤剂和清洗剂的用途；涉及所有具有相应修饰的足够类似的蛋白酶；以及涉及编码它们的氨基酸。本发明还涉及这些蛋白酶的方法和用途以及涉及试剂，特别是含有它们的洗涤剂和清洗剂。

蛋白酶属于所有酶中技术上最重要的。对于洗涤剂和清洗剂，它们是建立最久的酶，特别是含在所有现代高性能洗涤剂和清洗剂中。它们引起要清洗的材料上含蛋白污迹的分解。继而在这些之中，枯草杆菌蛋白酶类型(枯草杆菌酶(subtilases)、枯草杆菌肽酶，EC3.4.21.62)的蛋白酶是特别重要的，其由于催化有效的氨基酸而被分类为丝氨酸蛋白酶。它们作为非特异性内肽酶，水解位于肽或蛋白内的任何酰胺键。它们的最佳pH通常在显著的碱性范围。已有此家族的综述，例如，R.Bott和C.Betzel编辑的Subtilisin enzymespp.75-95中R.Siezen的文章Subtilases:subtilisin-like proteases,New York,1996。枯草杆菌酶由微生物自然形成；其中，要特别提到的枯草杆菌酶中最重要的组是由芽孢杆菌(Bacillus)物种形成和分泌的枯草杆菌蛋白酶。

偏好用于洗涤剂和清洗剂中的枯草杆菌蛋白酶类型蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶BPN'和Carlsberg，蛋白酶PB92，枯草杆菌蛋白酶147和309，来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)特别是来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶DY以及如下酶(然而，清楚起见，严格意义上是枯草杆菌酶而不再是枯草杆菌蛋白酶)：热酶(thermitase)、蛋白酶K、蛋白酶TW3及TW7、以及与初始蛋白酶相比包含修饰的氨基酸序列的前述蛋白酶的变体。蛋白酶可以使用本领域已知的方法以可控或随机方式被修饰，并由此被优化，例如用于洗涤剂和清洗剂。这些包括点诱变、缺失或插入诱变、或与其他蛋白或蛋白部分融合。现有技术中已知的大部分蛋白酶的相应优化变体因而是已知的。

国际专利申请WO95/23221和WO92/21760公开了适宜用于洗涤剂或清洗剂的来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶的变体。国际专利申请WO2011/032988进一步公开了同样含有来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶的变体的洗涤剂和清洗剂。这些文件中公开的蛋白酶变体可于来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶计数位置的3、4、99和199处(在另外的位置之外)被修饰，并且可在前述位置处包含例如氨基酸3T、4I、99D、99E或199I。然而，如下文所述的这些修饰的组合在这些文件中却并未提到。

现在令人吃惊地发现，包含若干个这些修饰的组合的来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶类型的蛋白酶或者与其足够类似的蛋白酶(基于序列相同性)特别适宜用于洗涤剂或清洗剂中并且特别有利于洗涤性能和/或稳定性的改善。

本发明的主题是蛋白酶，其包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列，并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

本发明的另一主题是制备蛋白酶的方法，包括向在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少70％相同的起始蛋白酶中引入根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

因此，用于本专利申请目的的蛋白酶既涵盖了前述的蛋白酶也涵盖了根据本发明方法制备的蛋白酶。因而所有涉及蛋白酶的陈述均是指作为物质的蛋白酶和相应的方法，特别是制备所述蛋白酶的方法。

分别与本发明的蛋白酶以及制备本发明蛋白酶的方法相关，作为本发明另外的主题的有编码所述蛋白酶的核酸，含有本发明的蛋白酶或核酸的非人类宿主细胞，以及包含本发明蛋白酶的试剂，特别是洗涤剂和清洗剂、洗涤和清洗方法及由本发明蛋白酶所定义的用途。