[发明专利]性能增强和温度抗性蛋白酶变体

权利要求书

1.一种蛋白酶，其包含在全长上与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列，并且包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外的氨基酸取代的组合。

2.一种蛋白酶，特征在于其可由权利要求1的蛋白酶作为起始分子，通过单个或多个保守氨基酸取代而得，其中所述蛋白酶包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合，

和/或

其可由权利要求1的蛋白酶作为起始分子，通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上相应于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合依然存在，

和/或

其可由权利要求1的蛋白酶作为起始分子，通过在比对中与SEQ ID NO.1的来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相关联的位置的一或多个氨基酸取代而得，其中该蛋白酶包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

3.用于制备蛋白酶的方法，包括将根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合引入到在全长上与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少70％相同的起始分子中。

4.权利要求3的方法，还包括一或多个如下方法步骤:

(a)引入单个或多个保守氨基酸取代，其中所述蛋白酶包含根据SEQID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合；

(b)通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变修饰氨基酸序列，修饰的方式是，所述蛋白酶包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265、或266个连续相连氨基酸的长度上相应于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合依然存在；

(c)向一或多个在比对中与SEQ ID NO.1的来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87、96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255、和268相关联的位置引入单个或多个氨基酸取代，其中所述蛋白酶包含根据SEQ ID NO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与选自S3T、V4I和V199I的至少两个另外氨基酸取代的组合。

5.编码权利要求1或2的蛋白酶或者编码根据权利要求3或4的方法获得的蛋白酶的核酸。

6.含有权利要求5的核酸的载体，特别是克隆载体或表达载体。

7.非人宿主细胞，其含有权利要求5的核酸或权利要求6的载体，或者含有权利要求1或2的蛋白酶，或者含有根据权利要求3或4的方法所获得蛋白酶，特别是将蛋白酶分泌至包围所述宿主细胞的培养基中的宿主细胞。

8.制备蛋白酶的方法，包括

a)培养权利要求7的宿主细胞，

b)从培养基或者从宿主细胞分离蛋白酶。