[发明专利]调控转基因表达的方法和组合物

说明书

相关申请案的交叉引用

本申请要求2011年9月21日提交的美国临时申请案No.61/537,349、2011年11月16日提交的美国临时申请案61/560,506和2012年7月11日提交的美国临时申请案61/670,490的利益，其公开内容据此通过引用整体并入。

技术领域

本发明属于基因组编辑领域。

发明背景

对于人类治疗的新纪元，基因疗法拥有巨大潜力。这些方法论将允许治疗标准医学实践尚不可解决的病状。基因疗法可包括基因组编辑技术的许多变型，例如破坏或修正基因座和插入可通过与转基因融合的特异性外源启动子或在插入基因组的位点发现的内源启动子控制的可表达转基因。

递送和插入转基因是对这种技术的任何真正实现必须解决的障碍的实例。例如，虽然有多种基因递送方法潜在可用于治疗使用，但是全部牵涉安全性、持久性和表达水平之间的大体权衡。提供转基因作为附加体(例如基本腺病毒、AAV和基于质粒的系统)的方法通常安全并且可产生高的初始表达水平，然而，这些方法缺乏稳健的附加体复制，这可能限制有丝分裂活跃组织中表达的持续时间。相反，导致所需转基因随机整合(例如整合慢病毒)的递送方法提供了更持久的表达，但是由于随机插入的非靶向特性，可能引起受体细胞生长不受调节，可能经由邻近随机整合的转基因盒的致癌基因活化导致恶性肿瘤。而且，虽然转基因整合避免了复制驱动的损失，但是未防止与转基因融合的外源启动子的最终沉默。随时间推移，对于大多数随机插入事件而言，此类沉默导致转基因表达减少。另外，转基因的整合很少在每个靶细胞中发生，这可使得难以达到目标转基因足够高的表示水平而不能达到所需疗效。

近年来，已经研发了新的转基因整合策略，其使用位点特异性核酸酶裂解以使插入偏向所选基因座(见，例如，共有美国专利7,888,121)。与经典整合方法相比，这种方法提供了提高转基因表达、增加安全性和表达持久性的前景，因为它允许精确的转基因定位，以使基因沉默或附近致癌基因活化的风险最小。

一种方法牵涉向其同源基因座插入转基因，例如向内源基因座插入野生型转基因以修正突变基因。可选地，转基因可插入因其有益性质而特别选择的非同源基因座中。见，例如，关于因子IX(FIX)转基因靶向插入的美国专利公布No.20120128635。如果希望用转基因取代内源基因的表达，同时仍维持内源调控元件发挥的表达控制，则靶向同源基因座可能有用。可使用在内源基因座内或附近裂解的特异性核酸酶并且可通过同源介导的修复(HDR)或通过非同源末端连接(NHEJ)期间的末端捕获在裂解位点整合转基因。使用或不使用转基因供体中供体和内源基因座之间的同源区域确定整合过程。

可选地，可将转基因插入可利用在安全港基因座处发现的启动子或允许在插入之前与转基因融合的外源启动子表达调控转基因的基因组中的特异性“安全港”位置。已经描述了几个此类“安全港”基因座，包括人类细胞中的AAVS1和CCR5基因及鼠类细胞中的Rosa26(见，例如，共有美国专利申请no.20080299580、20080159996和201000218264)。如上所述，可利用对安全港有特异性的核酸酶，以便通过HDR或NHEJ驱动的过程插入转基因构建体。

基因疗法的一个特别吸引人的应用牵涉治疗由分泌基因产物不足引起的病症或可通过分泌治疗性蛋白质治疗的病症。通过向适量细胞递送治疗性转基因可潜在解决此类病症，条件是每个受体细胞表达高水平的治疗性基因产物。在这种情况下，减少向大量细胞递送基因的需要可使得能够成功研发对其它顽固指征的基因疗法。此类应用将需要永久、安全且极高水平的转基因表达。因此研发表现出这些性质的安全港将提供在基因疗法领域中的实质实用性。

大量病症由分泌基因产物不足引起或可通过分泌治疗性蛋白质治疗。例如，凝血障碍是相当常见的遗传病，其中凝血级联中的因子以某种方式异常，即缺乏突变蛋白质的表达或生成。大多数凝血障碍导致血友病，例如甲型血友病(因子VIII缺乏)、乙型血友病(因子IX缺乏)或丙型血友病(因子XI缺乏)。对这些病症的治疗往往与严重程度相关。对于中度血友病，治疗可牵涉设计用于增加低表达因子的表达的疗法，而对于更严重的血友病，疗法牵涉定期输注缺少的凝血因子(常常每周2-3次)以防流血事件。往往不鼓励有严重血友病的患者参加许多类型的运动并且必须采取额外预防措施以避免每天受伤。