[发明专利]水解探针

说明书

发明背景

本申请要求2011年9月29日提交的美国临时专利申请序列号61／540,868的优先权。上述引用的公开内容通过引用整体并入本文。

1.技术领域

本发明一般性地涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及核酸的检测和定量。

2.相关领域描述

聚合酶链反应(PCR)是一种分子生物学技术，其通常在医学和生物学研究实验室中用于多种任务，例如遗传性疾病的检测、遗传指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因的克隆、亲子鉴定和DNA计算。PCR已经因其无可比拟的扩增能力和精确性而被分子生物学家公认为选择用于核酸检测的方法。DNA检测通常在PCR反应的终点或平台期进行，使得难以对起始模板进行定量。实时PCR或动力学PCR通过随着反应进行记录扩增子浓度来提高终点PCR分析能力。扩增子浓度最常通过与所扩增靶标相关的荧光信号变化来记录。实时PCR相对于终点检测来说的优势还在于污染受到限制，因为其可以在封闭的系统中进行。其他优点包括较高的灵敏度、动态范围、速度以及较少的所需程序。

若干测定化学已被用于实时PCR检测方法中。这些测定化学包括使用双链DNA结合染料、双重标记寡核苷酸(例如发夹引物和发夹探针)。其他化学包括基于外切核酸酶的探针(例如水解探针)。多种PCR和实时PCR方法公开于美国专利No.5,656,493、5,994,056、6，174,670、5,716,784、6,030,787、6,174,670和7,955,802中，其通过引用并入本文。

许多实时PCR技术的缺点是有限的多重(multiplexing)能力。使用游离在溶液中的报道子(reporter)荧光染料(fiuorochrome)的实时PCR技术在多重反应的每个测定中需要光谱不同的荧光染料。例如，设计为检测4个靶序列的多重反应会需要能够通过光谱差异来区分4种不同的自由漂浮(free floating)荧光染料的仪器，不包括对照。这些要求不仅限制实际多重能力，还提高成本，因为这样的仪器通常需要多个激光器和过滤器。

发明内容

在某些实施方案中，提供了检测核酸的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于在样品中检测靶核酸的方法，其包括：(a)使样品和与靶核酸第一链上第一区互补的第一靶特异性引物以及与所述第一区下游的靶核酸第一链上第二区互补的靶特异性探针在适于靶核酸与靶特异性引物以及靶特异性探针杂交的条件下相接触，其中所述靶特异性探针包含报道子并且与固体支持物相连接；(b)用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割杂交的靶特异性探针，以从固体支持物释放报道子；和(c)通过检测来自固体支持物上报道子之信号的变化来检测靶核酸。可以进行该方法以检测单一靶标或者可以包括另外的引物和探针以在多重测定中检测多种不同的靶核酸。例如，在一个实施方案中，该方法还包括：(a)使样品和与第二靶核酸第一链上第一区互补的至少第二靶特异性引物以及与所述第一区下游的第二靶核酸第一链上第二区互补的至少第二靶特异性探针在适于第二靶核酸与第二靶特异性引物以及第二靶特异性探针杂交的条件下相接触，其中第二靶特异性探针包含第二报道子并且与第二固体支持物相连接；(b)用具有外切核酸酶活性的核酸聚合酶切割第二杂交的靶特异性探针，以从第二固体支持物释放第二报道子；和(c)通过检测来自第二固体支持物上第二报道子之信号的变化来检测第二靶核酸。

第一固体支持物与第二固体支持物可以是同一固体支持物上的空间上离散的位置，例如平面阵列上的空间上离散的位置，或者第一固体支持物与第二固体支持物可以是物理上分离的(例如珠阵列)。在一种多重性方法中，不同的靶特异性探针相连的报道子可以是相同的，因为不同的靶特异性探针可以通过它们所连接的固体支持物来区分。但是，在一些实施方案中，使用两种或更多种不同的报道子。