[发明专利]用于降解有机磷酸酯的酶

说明书

技术领域

本发明涉及能够水解有机磷酸酯（organophosphate）（OP）分子的酶。

背景技术

有机磷酸酯（OP）杀虫剂残余物是环境以及一系列日用品中不期望的污染物。尤其敏感的领域包括土壤的污染、再循环的灌溉废水的污染（废水被下游的灌溉者使用或允许直接流出农场）、以及在农业和园艺出口商品中存在超出允许水平的残余物。有机磷酸酯中毒是暴露在此类化学品的农业工人面临的一个问题，对于暴露在化学战中所用的有机磷酸酯的军事人员也是如此。此外，储备的有机磷神经毒剂也需要对这些储备进行解毒处理。因此，需要一些生物修复（bioremediation）策略来清除或减少此类有机磷酸酯的残余物和/或储备。

提出的一个方案涉及使用能够固定或降解有机磷酸酯残余物的酶。例如，这些酶可用于生物反应器中，污染的水可能会流经所述生物反应器，或是在对水果、蔬菜或动物产品进行收获后杀虫（disinfestation）后用在洗涤溶液中以便降低残余物的水平和存留时间（withholding time）。适合用于对有机磷酸酯残余物进行降解的酶包括来自细菌的OP水解酶(Mulbry,1992；Mulbry和Kearney,1991；Cheng等，1999；US5,484,728；US5,589,386;Dong等，2005)、来自脊椎动物的OP水解酶(Wang等，1993；1998；Gan等，1991；Broomfield等，1999)、以及来自OP抗性昆虫的OP水解酶(WO95/19440和WO97/19176)。要求OP水解酶应该能够快速降解有机磷酸酯残余物。

研究得最为深入的OP降解酶是细菌的有机磷酸酯二水解酶(organophosphate dihydrolase，称为OPD、OPH或PTE)，其由黄杆菌菌种（Flavobacterium sp.）ATCC27551和缺陷短波单胞菌MG（Brevundimonas diminuta MG）中的不同质粒上相同基因编码(Harper等，1988；Mulbry和Karns,1989)。OPD是一种同二聚体蛋白，能够水解很多种磷酸三酯（氧OP和硫OP均可）（Dumas等，1989a,b）。其反应机制直接或间接地涉及金属离子，优选为Co⁺⁺、也包括Zn⁺⁺、Cd⁺⁺、Fe⁺⁺和其它二价阳离子。OPD对于磷酸单酯或二酯没有可检测到的活性(Dumas等，1989a,b；1990)。

已经在大肠杆菌（Escherichia coli）(ePHP)、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）(mtPHP)和肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）(mpPHP)的基因组中鉴定出了OPD同源物（磷酸三酯酶同源蛋白，或PHP），不过仅对ePHP的磷酸三酯酶活性进行了测试(Scanlan和Reid,1995；Buchbinder等，1998)。在ePHP的粗裂解物中未检测到对任何测试的底物具有活性，例如p-硝基苯乙酸酯、双(p-硝基苯)磷酸酯、对氧磷（paraoxon）和p-硝基苯磷酸酯。已鉴定出一类相关性更远的蛋白，其具有非常低水平的OP水解酶活性但是高水平的内酯酶活性，同样OPD酶也具有非常低水平的内酯酶活性（小于针对OP底物活性的0.001%）（Afriat等人，2006）。

在脊椎动物中也鉴定出了OPD同源物(Davies等，1997)，尽管其在这些生物中的功能仍是未知的。OPD、ePHP、mtPHP和哺乳动物的PHP在氨基酸水平具有27-30%的同一性，不过mpPHP的相似性稍低。在迄今为止所鉴定到的磷酸三酯酶家族的所有成员中，参与Zn⁺⁺结合的氨基酸残基都是保守的(Buchbinder等，1998)。

最近，从农杆菌中（Agrobacterium）分离出OP降解酶（WO02/092803;Horne等，2002;Jackson等，2009）。这种酶又称为OpdA，因其与OPD具有90%的氨基酸序列同一性。尽管OpdA与OPD在氨基酸水平上相关，它们已显示出针对不同OP的不同活性。

需要可用于生物修复策略中的其它OP降解酶。特别是，需要针对特定OP具有增强的活性的可用于生物修复领域的酶。

发明内容

本发明已鉴定的多肽与天然存在的OpdA相比具有改进的活性。

因此，在一方面，本发明提供一种多肽，其含有序列为如下的氨基酸：

i)如SEQ ID NO:1所示，