[发明专利]神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及人神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法、和通过该方法所制造的不溶性聚集体。具体为涉及在结构性地表达神经退行性疾病蛋白质的培养细胞内，通过重复将来自所述神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分作为晶种，进而使其形成不溶性聚集体的步骤的不溶性聚集体的制造方法、和通过该方法所制造的不溶性聚集体。

背景技术

显示各种疾病的特征性细胞内包含体（聚集体）出现在多数的神经退行性疾病的患者的脑内。在阿尔茨海默病（AD）中被称为神经纤维缠结、在帕金森病（PD）中被称为路易氏体的病理结构物全部为包括各种蛋白质的不溶性聚集体。作为神经纤维缠结的主要组成成分的Tau、作为路易氏体的主要组成馏分的α突触核蛋白、以及作为被认定为肌萎缩性侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis：ALS）的泛素阳性的细胞内包含体的主要组成成分的43kDa的TAR DNA结合蛋白质（TDP-43）被分别证实。这些在正常情况下作为可溶性蛋白质存在着，但在患者脑中则作为不溶性的异常的聚集体沉积着，且其机制至今仍不清楚。再者，由于表达这些聚集体的出现部位与神经细胞的脱落（细胞死亡）部位相关，因此，被推测为与出现在细胞内的这些聚集体具有细胞毒性，从而最终使神经细胞至死进而导致发病有关的机制。因此，被认为，通过细胞内聚集体的形成机制和聚集体去解明细胞死亡诱发机制等之事，能够对各种的神经退行性疾病的治疗药的开发等做出贡献。

为此，将于各种疾病的特征性细胞内聚集体再现于培养细胞内的体系构筑成为必要。但是，仅在细胞内表达过形成这些聚集体的蛋白质，从未出现于患者的脑中所见到的聚集体。近年，本申请的发明人们已确立了将用in vitro所制备的这些蛋白质的聚集体高效率地植入培养细胞内的方法（专利文献1、非专利文献1）。而且已表达:一旦将用in vitro所制备的所述聚集体植入事先已一时性地表达这些蛋白质的细胞内，则出现与在患者脑所见的细胞内聚集体其性质和形状类似的聚集体。这些聚集体仅为在细胞内一时性地表达该蛋白质的情况下，并不被完全认可，但一旦用in vitro所制备的所述蛋白质的聚集体被植入在所述细胞内，则该聚集体被形成为聚集的核，即成为晶种，由此在所述细胞中被形成为新的聚集体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1国际申请第WO2007/066809号公开公报

非专利文献1Nonaka，T.等、J.Biol.Chem.285:34885（2010）

发明内容

发明需要解决的问题

由用in vitro所制备的所述蛋白质的聚集体被形成在细胞内的聚集体与伴随所述神经退行性疾病的发展所出现的不溶性聚集体毕竟不同。在此，为了再现所述神经退行性疾病的发病过程，需要开发再现将在所述神经退行性疾病的患者的脑内所形成的不溶性聚集体作为种，进而在细胞内形成聚集体的过程的实验体系。再者，为了详细地解析在细胞内形成聚集体的过程，需要大量地得到在患者的脑内所形成的不溶性聚集体。但是，由于在患者的脑内所形成的不溶性聚集体其量受限，因此，需要开发制备相同性质的不溶性聚集体的方法。

为解决以上问题的方法

本发明提供一种神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法,其包括：步骤（1），其将来自神经退行性疾病的患者的脑的不溶性馏分植入在被结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内；步骤（2），其培养已被植入所述不溶性馏分的所述培养细胞；步骤（3），其从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。

本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法包括：步骤（4），其为在培养细胞中增幅神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的步骤，该步骤包括将从培养细胞中所萃取的不溶性馏分植入在结构性地表达神经退行性疾病关联蛋白质的培养细胞内，且培养已植入所述不溶性馏分的所述培养细胞，并且从所述培养细胞中萃取不溶性馏分。

本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法可能包括：步骤（5），其进一步至少1次连续重复所述步骤（4）。

本发明的神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的制造方法中，其神经退行性疾病关联蛋白质有可能为从包括TAR、DNA结合蛋白质、α突触核蛋白、Tau蛋白质、β-淀粉样蛋白、多聚谷氨酰胺、SOD1以及朊蛋白质的组中所选择。

本发明提供通过本发明的制造方法所获得的所述神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体。

本发明提供从生物学性试样制造神经退行性疾病关联蛋白质的不溶性聚集体的方法。其包括：