[发明专利]降低基因组复杂度和多态性检测的方法

说明书

相关申请的引用

本申请要求2011年6月27日提交的61/571,472号和2011年11月4日提交的61/555,711号美国临时申请的优先权，且上述申请的全文通过引用在此引入。

序列表的并入

序列表包含在名为“UFFL012WO_ST25.txt”的文件中，其在微软Windows操作系统中测量为7千字节并在2012年6月27日创建，其以电子方式随本文提交并通过引用引入。

发明领域

本发明一般涉及分子生物学和遗传学领域。更具体地说，本发明涉及DNA测序和基因分型。

发明背景

广泛的努力一直致力于人类、植物和动物种群的基因分型来揭示遗传关系，并在许多其它用途中确认调节临床和农艺性状的基因。目前的方法是昂贵的并依赖于大量个体。需要产生用于测序和DNA多态性检测的基因组简化形式（reduced representation of genome）的技术。

发明概述

在一个方面，本发明提供了产生用于测序和DNA多态性检测的基因组简化形式的方法，其包括如下步骤：（a）通过聚合酶链反应（PCR）使用第一寡核苷酸引物组对基因组的区域进行扩增以产生第一核酸产物，其中所述第一引物组的引物之一包含，从3'末端开始：（ⅰ）在所述引物的3'末端的特异性序列，其中所述特异性序列结合所述基因组的独特靶区域，（ⅱ）结合基因组中所有可能的序列组合的序列，在某些实施方式中，其可以是简并的或通用的核苷酸序列，以及（iii）与在所述方法的步骤（c）中使用的寡核苷酸引物的序列互补的尾序列；（b）通过将步骤（a）的核酸产物与双链特异性核酸酶接触有效量的时间以消化步骤（a）的最丰富的双链核酸而标准化步骤（a）的核酸产物；和（c）使用第二寡核苷酸引物组通过PCR扩增步骤（b）的标准化的核酸产物以产生具有接头序列的第二核酸产物，其中所述的第二引物组的引物包含，从5'末端开始：（i）被设计为支持DNA分子与表面结合的接头序列；和（ⅱ）与步骤（a）的所述引物的所述尾序列互补的序列，并且其中步骤（c）的所述核酸产物代表所述基因组的简化形式。

在本发明的一个实施方式中，第一寡核苷酸引物包含条码序列。在另一个实施方式中，所述第一寡核苷酸引物的特异性序列包含约5至约10个核苷酸，并且可以包括约5、6、7、8、9或10个核苷酸。在另一个实施方式中，所述第一寡核苷酸引物的特异性序列包含6个核苷酸。在本发明的其它实施方式中，所述第一寡核苷酸引物的简并序列包含约5至约15个核苷酸，并且可以包括约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在又另一个实施方式中，所述第一寡核苷酸引物的简并序列包含10个核苷酸。

在另一个实施方式中，本发明提供包含约5至约15个核苷酸的通用核苷酸序列而不是简并序列的用途。其它实施方式提供了约15至约25个循环的PCR扩增循环数目。在另一个实施方式中，双链特异性核酸酶来自勘察加蟹（kamchatka crab）。在又另一个实施方式中，双链特异性核酸酶与步骤（a）的核酸产物接触约2至约8小时。在另一个实施方式中，对步骤（c）的核酸产物进行测序。在另一个实施方式中，产生多个基因组的简化形式。在又另一个实施方式中，步骤（b）和（c）包含复用多个样品。

在另一个方面，本发明提供了寡核苷酸引物，其包含，从3'末端开始：（i）在所述引物的3'末端的特异性序列，其中所述特异性序列结合基因组的独特靶区域；（ⅱ）结合基因组中的所有可能的序列组合的序列，在某些实施方式中，其可以是简并的或通用的核苷酸序列，以及（iii）与步骤（c）中使用的寡核苷酸引物的序列互补的尾序列；或第二寡核苷酸引物，其包含，从5'末端开始：（ⅰ）被设计为支持DNA分子与表面的结合的接头序列；和（ⅱ）与步骤（a）中的引物的尾序列互补的序列。