[发明专利]用于固氮的筛选

说明书

发明领域

本申请涉及固氮，更特别地，涉及用于检测谷氨酰胺的培养基及其方法和应用。

发明背景

氮是全球农业生产的支柱之一。许多人提出在全球农业中提高肥料氮的使用效率对于这个星球的长期可持续性是必要的。

氨基酸谷氨酰胺(Gln)是所有生命氮代谢中的重要中间体。在植物中，氮肥被同化为Gln(12,39)并随后转化为谷氨酸；这些氨基酸一起作为各种反应，包括其它氨基酸的生物合成，的氮供体(34,39)。这些氨基酸进一步调节土壤硝酸盐和铵的摄取和同化(13,25,29,40,61)。Gln以及天冬酰胺是植物中用于长距离运输，包括从根部至芽部，的重要的氮形式(49)。事实上，将氮肥应用到玉米(Zea mays L.)植物的根部可以使根部和芽部的Gln和其它氨基酸的水平在30-120分钟内分别产生大幅度的增加(34)。因此Gln是植物中氮状态的关键指示物。遗憾的是，尽管在全球农业中氮作为最具限制性的土壤养分很重要，但目前仅存在对植物氮状态进行定量测定的间接的或延迟的检测(55)。

游离Gln主要通过对组织提取物进行的基于高效液相色谱(HPLC)的分析进行定量测定(1,38,43,47)。生物传感器在Gln的定量测定上的应用是有限的。Gln结合蛋白(QBP)(32)，来自于细菌的细胞周质间隙，已被用于构建使用水提取物的Gln无试剂传感器(14,15)。对于细胞生物学的应用来说，已在转基因拟南芥植物中构建了基于共振能量转移(FRET)QBP的生物传感器以在荧光显微镜下监测根尖的Gln摄取(63)。这种生物传感器对于Gln具有毫摩尔的灵敏度以及优越的亚细胞分辨率和好的特异性，但是需要生成转基因植物，其可能更不适合高通量的应用，包括植物氮状态的确定。

微生物全细胞生物传感器已被用做低成本工具，用于定量测定来自于其被共接种到其中的生物提取物的被分析物(18,50)。它们还被用于观察非转基因生物体的完整组织中的被分析物。例如，可以利用邻近的微生物生物传感器细胞检测植物中蔗糖、色氨酸或铁的泄漏并随后成像(27,33)。

微生物生物传感器亚集(subset)是基于表达组成型报道分子(例如绿色荧光蛋白，GFP，lux)的营养缺陷体。营养缺陷体是在缺乏特定代谢物时不能生长的生物体。氨基酸营养缺陷体在定量测定人和动物食品中生物可利用的必需氨基酸例如赖氨酸中的应用开始于数十年前(6,7,18,26,48,60)。大肠杆菌的Gln营养缺陷体通过下调编码谷氨酰胺合成酶的基因(GlnA)而产生(36)。

目前可用于谷氨酰胺测定的大多数方法具有价格昂贵、耗费时间以及需要一定水平的专业技术的缺点。而且，传统方法是间接的或延迟的。因此希望提供用于检测谷氨酰胺的组合物、培养基和方法，以缓解现有技术的至少一个问题或缺点。

发明概述

本发明提供了用于检测很多样品例如但不限于植物或植物产品、土壤和微生物中的谷氨酰胺的培养基。由于植物、土壤或微生物中谷氨酰胺的存在可用做氮水平的指示物，因此所述培养基可用在鉴别、筛选、选择或检测植物、植物产品或土壤中的固氮或氮含量的方法中，或者鉴别、筛选、选择、检测或培养固氮微生物或接种固氮微生物（inoculant nitrogen-fixing microbe）的方法中。

在一些方面，所述培养基包括谷氨酰胺生物传感器(glutamine biosensor)以指示微生物、植物或土壤中的氮，或者，更特别地，谷氨酰胺的状态。当加入培养基的样品或被分析物中存在谷氨酰胺时，谷氨酰胺生物传感器提供信号。该信号可以是定性的，提供有关被分析物中是否存在氮或谷氨酰胺的信息。该信号也可以是定量的，提供对被分析物中氮或谷氨酰胺的量的测量。所述培养基基本不含谷氨酰胺(essentially free of glutamine)，其意思是在所述培养基中只有很少或者不存在(little to no)谷氨酰胺。

根据本发明的一个方面，提供了基本不含谷氨酰胺的生长培养基，其包括用于检测被分析物中的谷氨酰胺的谷氨酰胺生物传感器。

根据本发明的一个方面，谷氨酰胺生物传感器包括细菌细胞，例如大肠杆菌。在另一个方面，细菌细胞是谷氨酰胺营养缺陷体。在另一个方面，与野生型细菌细胞相比，所述细菌细胞中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)被下调。

根据本发明的另一个方面，该细菌细胞包含在存在谷氨酰胺的条件下表达的报道基因。在另一个方面，报道基因是lux。