[发明专利]使用适用于具有低容积传氧系数KLa的发酵罐的丝状真菌用于生产纤维素酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用对于木质纤维素生物量酶水解必需的丝状真菌生产纤维素酶的方法，所述丝状真菌用在例如称为第二代方法的生物燃料的生产方法中，或化工、造纸及纺织工业的其它方法中。

现有技术

用于生产第二代生物燃料的经济上可行的方法的开发目前是一个“热点”。这些燃料从木质纤维素生物量生产，并且与从甘蔗、玉米、小麦或甜菜生产的“第一代”生物燃料相比，在关于与用于食物的农业用地的使用竞争方面产生更少的问题。

木质纤维素生物量表征为由三个主要级分组成的复杂结构：纤维素、半纤维素和木质素。将其转化成乙醇的常规方法包括一些步骤。预处理可以使纤维素能与酶，即纤维素酶接触。酶水解步骤可以用于转化纤维素成葡萄糖，其然后在发酵步骤过程中转化成乙醇，所述发酵通常使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。最后，蒸馏步骤可以从发酵液（fermentation must）中分离并回收乙醇。

各种技术-经济的研究已证明，减少纤维素酶的成本是在从木质纤维素物质开始的生物乙醇生产方法中的关键点之一。目前，工业纤维素酶主要是由丝状真菌，里氏木霉（Trichoderma reesei）生产，因为其高的纤维素酶分泌能力。该工业上应用的策略是使真菌快速增长到一个给定的浓度，然后诱导纤维素酶的产生，以使生产率和产量最大化。里氏木霉是严格好氧的并且它的生长会导致培养基粘度的大幅度增加，使氧的传递困难，氧的传递对其生存是必需的。氧传递与K_La值有关，其被称为每单位体积培养基的容积传氧系数。其是系数K_L（以m/s或m/h表示的总O₂交换系数）与系数“a”的（以m²/m³培养基表示的每单位液相培养基体积的具体交换面积）的乘积。K_La值正比于搅拌和通气。为了满足在真菌生长阶段增加的对氧的生物需求，有必要增加氧传递，一般通过增加搅拌或通气流速来实现。这导致方法的能量消耗（用于搅拌的电机和用于通气的压缩机的功率）增加，结果操作成本增加。搅拌和通气相关的成本可以代表用于生产纤维素酶的方法的至多达50％的操作成本。

因此，减少酶的生产成本的一种方法是通过修饰方法的操作减少操作成本，以便最大限度地减少所需的K_La，同时保持纤维素的生产率。这也意味着，关于工业发酵罐尺寸（通常100-1000 m³）的规模放大可以被简化，其对于超过200 h^-1的K_La值变得困难。

里氏木霉酶复合物的酶类包含三个主要的活性类型：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纤维二糖酶或β-葡萄糖苷酶。具有对木素纤维素材料的水解至关重要的功能或活性的其他蛋白也由里氏木霉产生，例如木聚糖酶。诱导物底物的存在对纤维素分解和/或半纤维素分解酶的表达是至关重要的。

对针对各种碳源的纤维素酶基因的调控已经进行了详细研究。它们在纤维素、其水解产物（例如：纤维二糖）或某些低聚糖，例如乳糖或槐糖的存在下诱导（IImén 等，1997; Appl Environ Microbiol 63: 1298-1306）。

常规突变基因技术已经能够选择高产纤维素酶的里氏木霉菌株，例如株MCG77（Gallo -专利US4275167）、MCG80（Allen, A.L. and Andreotti, R.E., Biotechnol- Bioengi 1982, 12, 451-459 1982）、RUT C30（Montenecourt, B.S. and Eveleigh, D.E., Appl Environ Microbiol 1977, 34, 777-782）和CL847（Durand等, 1984, Proc Colloque SFM Génétique des microorganismes industriels [Genetics of industrial microorganisms]. Paris. H. HESLOT Ed, pp 39-50）。

为了获得良好的酶生产率，用于生产纤维素酶的工业方法，例如专利FR 2881753中所述，例如，是以两个步骤进行：

·      “分批”模式的生长步骤，其中其对于提供可快速吸收用于里氏木酶生长的碳源是必需的，然后