[发明专利]鞘磷脂的测定方法和测定用试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及鞘磷脂的测定方法和测定用试剂盒。

背景技术

在血液中含有高密度脂蛋白(以下简记为HDL)、低密度脂蛋白(以下简记为LDL)、极低密度脂蛋白(以下简记为VLDL)、乳糜微粒(以下简记为CM)等脂蛋白。各脂蛋白的胆固醇、甘油三酯、磷脂、蛋白质等构成成分的比例不同，在生物体内具有不同的作用。在脂蛋白中主要含有三种磷脂，即，磷脂酰胆碱(以下简记为PC)、溶血磷脂酰胆碱(以下简记为LPC)、鞘磷脂(以下简记为SM)。

在这三种磷脂中，PC和SM为主要的磷脂，分别占全部磷脂的约7成和约2成。已知SM蓄积在人和动物模型的粥样斑块(Atheroma)中。存在于人的动脉硬化斑块中的LDL，与血浆中的LDL相比，含有更多的SM(非专利文献1)。

另一方面，在人的临床研究中也显示出血浆中的SM和SM/PC比率是相对于缺血性心脏病而言独立的危险因素(非专利文献2～4)。

至今，作为SM的测定方法，报道了使用薄层色谱的方法和使用高效液相色谱的方法(非专利文献5)，但具有操作烦杂且测定需要长时间等缺点。另外，也报道了利用来源于细菌的鞘磷脂酶的酶测定法(专利文献1、非专利文献2)。本测定法为如下方法：将鞘磷脂通过细菌的鞘磷脂酶水解成磷酸胆碱和N-酰基鞘氨醇，将生成的磷酸胆碱通过碱性磷酸酶水解成胆碱，使生成的胆碱与胆碱氧化酶反应，测定生成的过氧化氢，由此，测定鞘磷脂。但是，本测定法具有因使用碱性磷酸酶而产生的对其他测定项目的测定的影响、鞘磷脂酶与SM一起同LPC反应的特异性等问题(非专利文献6)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2009-519713号公报

非专利文献

非专利文献1：Circulation,Vol.110(22),p.3465-3471(2004).

非专利文献2：Arterioscler Thromb Vasc Biol.,Vol.20,p.2614-2618(2000).

非专利文献3：Nutrition&Metabolism,Vol.3,p.5(2006).

非专利文献4：Am.J.Epidemiol.,Vol.163,p.903-912(2006).

非专利文献5：Dairy Sci.,Vol.88,p.482-488(2005).

非专利文献6：Biol.Pharm.Bull.Vol.27,p.1725-1729(2004).

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，提供用于简便并且准确地测定样本中的SM的方法和试剂盒。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述问题而进行了深入的研究，发现，在选择性地测定含有PC、LPC和SM的样本中的SM的方法中，通过使用不与使LPC与溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶反应而生成的甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应但与SM反应的磷脂酶D，能够特异性地测定SM，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下的[1]～[17]。

[1]一种样本中的SM的测定方法，其特征在于，使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。

[2]一种样本中的SM的测定方法，其特征在于，使样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并消去生成的过氧化氢，接着，使样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、氧化型辅酶、胆碱脱氢酶以及还原型辅酶氧化酶反应，并测定生成的过氧化氢。

[3]如[1]所述的方法，其中，在过氧化氢酶存在下进行样本与不与SM和LPC反应而与PC反应的磷脂酶D、溶血磷脂酶或单甘油脂肪酶、以及胆碱氧化酶的反应，在过氧化氢酶抑制剂存在下进行样本与不与甘油-3-磷酸胆碱和游离脂肪酸反应而与SM反应的磷脂酶D、以及胆碱氧化酶的反应。