[发明专利]核酸扩增

说明书

技术领域

本发明涉及对一定量的核酸进行扩增的方法和试剂盒。本发明特别地涉及等温扩增技术。经扩增的核酸可以被传感器检测到。

背景技术

在进行遗传分析时，往往由于样品中存在的拷贝数太少而无法进行检测，通常需要对样品中的拷贝数进行扩增。

例如，可以采用热循环扩增或等温扩增完成这个过程。

等温扩增技术包括SDA、LAMP、SMAP、ICAN、SMART。通过链置换反应在恒温下进行该反应过程。通过在恒温下孵育包含样品、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶以及底物的混合物，可以一步完成扩增。

在环介导等温扩增（LAMP）技术中，采用4至6个被特别设计为分别识别靶基因中的6至8个特定区域的不同引物，来完成靶特异性扩增。Eiken Chemical的专利EP2045337“Process for synthesizing nucleic acid”中进一步描述了LAMP技术，在此通过引用的方式将其并入本文中。

这种方法通常能够在15-60分钟内将核酸拷贝扩增10⁹-10¹⁰倍。

除了引物之外，链置换技术使用Tris和硫酸盐化合物（例如MgSO₄、NH₄SO₄）来保持酶的功能性。

Tris为具有式(HOCH₂)₃CNH₂的有机化合物（正式名称为三(羟甲基)氨基甲烷）。诸如LAMP之类的链置换技术使用Tris作为缓冲剂，使反应维持在最佳pH值。

Tris和硫酸盐的推荐浓度分别为大于等于20mM和12-20mM。

核酸扩增后，核酸检验需要二级检测技术，例如分光光度法、浊度法、LFD（横向流动试纸条法）或荧光素酶法。然而，这些已知的技术存在缺陷。荧光试剂需要标记以发出紫外荧光，因而耗费昂贵。此外，诸如SYBR绿等试剂与DNA结合，使其本身具有致癌性；埃姆斯试验（Ames Test）表明其具有致突变性和细胞毒性。而且，SYBR绿是非特异性的，其可以附着在任意双链DNA上，因此增强了背景信号。浊度测量需要昂贵的仪器以提供量化。最后，LFD中所用试剂需要二次偶联，其对非特异性检测敏感。

现有的等温扩增技术不适用于采用pH检测的体系。因此，该领域存在这样的需求：需要一种对核酸进行等温扩增并且能够利用安全廉价的设备有效地对其进行检测的试剂盒和方法。令人惊讶的是，发明人已经发现所用的试剂可以提高扩增的产量。

发明内容

根据本发明的第一个方面，提供了一种试剂盒，其中的试剂可组合形成用于核酸等温扩增的混合物，所述试剂盒包括：镁盐、季铵盐和碱金属碱。

所述混合物的缓冲容量可以被设置为小于用扩增时释放的质子的期望浓度除以pH变化阈值得到的值，所述pH变化是通过暴露于所述混合物的传感器检测得到的。

所述混合物的缓冲容量可以被设置为小于用扩增时释放的质子的期望浓度除以pH变化阈值所得值的一半，所述pH变化阀值是通过暴露于所述混合物的传感器检测得到的。

所述待检测的pH变化阈值可以为所述感受器的检测限值。

在用于所述扩增的操作条件下，所述混合物的缓冲容量可以小于10mM，优选地小于5mM，更优选地小于1mM。

所述混合物中的缓冲剂的浓度可以小于5mM，更优选地小于3mM、小于2mM或小于1mM。

如果存在硫酸盐化合物的话，其浓度可以小于15mM，优选地小于10mM、小于8mM、小于5mM或小于1mM。

所述季铵盐的浓度为介于2mM和15mM之间，所述季铵盐优选为氯化铵。

所述碱金属碱的浓度使得所述混合物的pH介于6和9之间，优选地介于7和8.8之间，更优选地介于8.3和8.6之间。

所述碱金属碱为NaOH、KOH或LiOH之一。

在核酸扩增过程中还可以使用一种或多种引物，所述引物为等位基因特异性的，从而使得扩增能够显示目标核酸的存在。

所述等温扩增可以为链置换扩增，优选为环介导等温扩增（LAMP）。

所述混合物的缓冲容量可以基本上屏蔽（mask）非扩增时所释放的质子的预期量。

所述试剂盒还可以具有链置换酶、核苷酸和引物，其中优选地这些试剂中的至少一种与其余试剂分开存放。