[发明专利]表达重组DSBC的细菌宿主菌株

说明书

本发明涉及重组细菌宿主菌株，特别地大肠杆菌(E.coli)。本发明还涉及用于在此类细胞中产生目标蛋白质的方法。

发明背景

细菌细胞例如大肠杆菌通常用于产生不需要糖基化的重组蛋白质。特别地，由于细菌细胞用作宿主细胞允许通过质粒进行基因插入的通用性质，因此使用细菌细胞例如大肠杆菌来产生重组蛋白质具有许多有利方面。大肠杆菌已被用于产生许多重组蛋白，包括人胰岛素。

尽管使用细菌细胞产生重组蛋白质有许多有利方面，但仍然存在重大限制，包括不良的细胞健康表型。

因此，仍然需要提供新型细菌菌株，所述菌株为产生重组蛋白质提供有利的工具。

体液和细胞介导的免疫的产生通过活化的辅助T细胞与抗原呈递细胞(“APC”)和效应T细胞的相互作用来进行协调。辅助T细胞的活化不仅依赖于抗原特异性T细胞受体(“TCR”)与其关联肽MHC配体的相互作用，而且还需要许多细胞粘附和共刺激分子的协同结合(coordinate binding)和活化。

结合CD40的天然受体是CD40配体(CD40-L=CD154)，一种以活化依赖性、时间限制的方式在CD4+T细胞表面上表达的至关重要的共刺激分子。CD154在活化后也在CD8+T细胞的一个亚组，嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞和血小板上表达。CD40组成型地、广泛地在许多细胞类型包括B细胞和其它抗原呈递细胞的表面上表达。

在CD154结合后通过CD40进行的信号转导起始了细胞事件的级联，所述级联导致具有CD40受体的细胞的活化和最优CD4+T细胞初敏。更具体地，CD154对CD40的结合促进B细胞分化成抗体分泌细胞和记忆B细胞。

CD154在调节体液和细胞介导的免疫应答的功能方面的中枢作用已激起人们对将该途径的抑制剂用于治疗性免疫调节的极大兴趣。因此，已显示抗-CD154抗体在众多的针对其它治疗性蛋白质或基因疗法、变应原、自身免疫和移植的免疫应答的模型中是有益的(参见，例如，US 5,474,771和WO 2008/118356，其通过引用整体并入本文)。

本领域需要高效且经济地产生大量干扰CD40与CD154的相互作用、且适合于治疗性应用的抗体或抗体片段。

发明概述

本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含：

a)编码DsbC的重组多核苷酸；和

b)一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

更具体地，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其特征在于所述细胞：

a)包含编码DsbC的重组多核苷酸；

b)相较于野生型细胞具有减小的Tsp蛋白活性，和

c)一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

在一个实施方案中，细胞包含野生型spr基因或突变的spr基因，其例如能够抑制具有减小的活性的Tsp表型。

根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞显示有利的生长和蛋白质生产表型。

更具体地，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，所述细胞包含编码包含组氨酸(His)-标签的DsbC多肽的重组多核苷酸，优选地其中DsbC多肽包含序列his-his-his-his-his-his(6x组氨酸)。

更具体地，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸含有具有根据SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:51的序列的多核苷酸。

本发明还提供了包含编码DsbC和特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的重组多核苷酸的表达载体。

更具体地，本发明提供了表达载体，所述表达载体包含编码含有组氨酸(His)-标签的DsbC多肽的重组多核苷酸，优选地其中DsbC多肽包含序列his-his-his-his-his-his(6x组氨酸)。

更具体地，本发明提供了包含重组多核苷酸的表达载体，所述重组多核苷酸含有具有根据SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:51的序列的多核苷酸。

本发明还提供了用于产生特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：

a)在有效表达特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段以及编码DsbC的重组多核苷酸的条件下，在培养基中培养上文中定义的重组革兰氏阴性细菌细胞；和