[发明专利]通过互补测序识别抗生素靶标的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于识别在细菌内作为抗生素靶标的必需基因的方法，涉及用于识别抗生素的方法以及涉及用于生产包括所述抗生素的抗生素和药物组合物的方法。

背景技术

对于抵抗新的病原体的出现和对现有抗微生物药的耐药性的新的抗生素存在迫切需要。识别候选抗生素的靶标是至关重要的，因为这些信息能够为获得大量功能相关的新型药类提供途径。例如，作为青霉素靶标的青霉素结合蛋白的发现导致开发了一大类抗生素，包括数代的头孢菌素类、青霉素类以及碳青霉烯类（参见Schmid(2006)Nature Biotechnology24(4):419-420）。

目前已经描述了转座子引导的插入位点测序（TraDIS-参见Langridge et al.(2009)Genome Research19:2308-2316），并且用于识别：（a）必需基因；（b）有利于生长（但非必需）的基因；（c）在特定条件下不利于生长的基因；以及（d）与对某些条件提供耐受性有关的基因（“小环境特异性（niche-specific）”必需基因）。已经在例如Gawronski et al.(2009)PNAS106:16422-16427；Goodman et al.(2009)Cell Host Microbe6:279-289；van Opijnen et al.(2009)Nat.Methods6:767-772以及Gallagher et al.(2011)mBio2(1):e00315-10中描述类似的技术，并且这类技术目前共同地被称为“Tn-seq”方法。

然而，一类重要的抗生素靶标是与在所使用的生长条件中生存所必需的细胞过程有关的基因产物。这类靶标不能通过Tn-seq（包括TraDIS）识别，因为转座子插入至必需基因（包括作为抗生素靶标的那些）没有明显表现在初始突变株库（initial mutant pool）中。因此，在有或没有（或有不同量的）抗生素的情况下生长突变株库后不会出现转座子分布的差异，以该结果Tn-seq不能区别必需基因和作为抗生素靶标的必需基因。

因此需要对于能够识别作为抗生素靶标的必需基因的抗生素靶标的高通量功能筛选。

发明内容

根据本发明的一个方面，提供用于识别在细菌内作为抗生素靶标的必需基因方法，该方法包括步骤：

（a）通过包括在所述抗生素的存在下对生长进行选择以产生抗生素抗性突变株克隆的步骤的方法来产生所述细菌的抗生素抗性突变株（Ab^R突变株）；

（b）用：（i）所述细菌的一个或多个必需基因；以及（ii）插入时使细菌DNA失活的转座子来转化Ab^R突变株，以产生对于所述一个或多个必需基因来说是局部二倍体的并且带有转座子介导的失活基因的转座子突变株的库；

（c）在不同量的所述抗生素的存在下，使来自局部二倍体库的细菌生长以产生两种以上的测试培养物；以及

（d）比较测试培养物之间的转座子插入的分布以识别在所述细菌内作为所述抗生素的靶标的推定必需基因。

优选地，在步骤（b）中首先用包含所述细菌的一个或多个必需基因的载体DNA转化Ab^R突变株。进一步地，在步骤（b）中首先用包含所述细菌的一个或多个必需基因的载体DNA然后用转座子转化Ab^R突变株。在这些实施方式中，可以首先用染色体外元件（extrachromosamal element）（例如质粒或BAC）转化所述Ab^R突变株，所述染色体外元件包括：（i）所述细菌的一个或多个必需基因；和（ii）一个或多个转座子重复序列；然后用转座子递送质粒转化（例如通过与供体细菌结合），所述转座子递送质粒包含：（i）编码转座酶的基因；和（ii）反序重复转座酶识别位点；其中染色体外元件的一个或多个转座子重复序列提供对由转座子递送质粒所递送的转座子的转座子免疫性。

该方法可以进一步包括步骤：

（a）通过用激活转座子（Tn_A）的转座子诱变产生突变细菌库，其中Tn_A包括启动子，以使进入细菌DNA的转座子插入增加插入位点处或附近的基因的转录；

（b）在不同量的所述抗生素的存在下，使来自突变株库的细菌生长以产生两种以上的测试培养物；以及

（c）比较测试培养物之间Tn_A插入的分布以识别在所述细菌内作为所述抗生素的靶标的推定必需基因。