[发明专利]通过互补测序识别抗生素靶标的方法

权利要求书

1.一种用于识别在细菌内作为抗生素靶标的必需基因的方法，所述方法包括步骤：

(a)通过包括在所述抗生素的存在下对生长进行选择以产生抗生素抗性突变株克隆的方法产生所述细菌的抗生素抗性突变株，将其命名为Ab^R突变株；

(b)用以下来转化所述Ab^R突变株：(i)所述细菌的所述必需基因的野生型拷贝，以产生具有野生型拷贝和其Ab^R突变株拷贝的局部二倍体；以及(ii)插入时使细菌DNA失活的转座子，以产生对于所述必需基因来说是杂合的局部二倍体的转座子突变株的库；

(c)在不同量的所述抗生素的存在下，使来自所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库的细菌生长以产生两种以上的测试培养物，其中进入作为抗生素靶标的所述必需基因的转座子插入存在于非选择性的所述抗生素的量下，即当必需基因的野生型拷贝与其插入失活的Ab^R突变株拷贝互补时，而不是在选择性的所述抗生素的量下，即当必需基因的野生型拷贝与其插入失活的突变拷贝不互补时；以及

(d)比较测试培养物之间的转座子插入的分布以识别在所述细菌内作为所述抗生素的靶标的推定必需基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含至少0.5x10⁵个突变株。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含至少5x10⁵个突变株。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含至少1x10⁶个突变株。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含0.5x10⁶至2x10⁶个突变株。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含1x10⁶个突变株。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每50个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每30个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每25个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每15个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。

11.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每10个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。

12.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，步骤(b)的所述细菌DNA是基因组DNA。

13.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，步骤(b)的所述细菌DNA是质粒DNA。

14.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述细菌是革兰氏阳性菌。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述细菌选自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)和淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)。

16.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述细菌是革兰氏阴性菌。