[发明专利]基于探针的核酸检测

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年5月9日提交的美国临时申请号61/484,198的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。

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技术领域

本发明涉及适于核苷酸多态性(SNP)基因分型和其他基因分析的基于PCR的检测系统。

背景技术

荧光报告物分子-猝灭剂分子对已被掺入探针寡核苷酸上以便基于被分开或置于彼此最小的猝灭距离内的荧光报告物分子和猝灭剂分子监测生物事件。例如，已开发了探针，其中由于报告物分子从猝灭剂分子的分开，报告物分子荧光的强度增加。还开发了因为猝灭剂被引入与报告物分子接近而失去它们的荧光的探针。这些报告物-猝灭剂分子对探针已被用于通过监测由报告物分子产生的荧光信号的出现或消失而监测杂交分析和核酸扩增反应，特别地聚合酶链式反应(PCR)。

关于包含报告物-猝灭剂分子对的探针的一个特别重要的应用是它们在核酸扩增反应，诸如聚合酶链式反应(PCR)中检测靶核酸序列的存在和扩增的用途。通常，核酸扩增技术为基因检测和DNA分析打开了广泛的新方法。Arnheim和Erlich,Ann.Rev.Biochem.,61:131-156(1992)。特别地，PCR已成为至关重要的研究工具，在例如，克隆、基因表达分析、DNA测序、基因作图和药物发现中应用。Arnheim和Erlich,Ann.Rev.Biochem.,61:131-156(1992)；Gilliland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.87:2725-2729(1990)；Bevan等人，PCR Methods and Applications,1:222-228(1992)；Green等人，PCR Methods and Applications,1:77-90(1991)；Blackwell等人，Science,250:1104-1110(1990)。

发明内容

因此，对当与靶核酸序列杂交和未杂交时呈现可区别的荧光特征的探针存在需求。对其中报告物分子和猝灭剂分子被定位在检测对上如此以致猝灭剂能够有效猝灭报告物分子的荧光的探针存在另外的需求。对被有效合成的探针存在另外的需求。对检测方法存在另外的需求，其中少数合成的探针可被用于大量的分析。对具有高特异性的检测方法存在又另外的需求。对报告物分子和猝灭剂分子定位在检测对上如此以致当序列特异性杂交时报告物和猝灭剂分子足够靠近彼此的基于接近的猝灭存在另外的需求。

本发明的探针和方法提供了这些和另外的目的。

在一个方面，本发明提供了用于检测靶核苷酸序列的方法，包括：

a)用核苷酸标签序列将所述靶核苷酸序列加标签，从而制备加标签的靶核酸序列；

b)提供包含与所述核苷酸标签序列互补的核苷酸标签识别序列和所述核苷酸标签识别序列的5'端的调节序列的探针寡核苷酸，其中所述探针寡核苷酸包含第一标记物并具有解链温度Tm1；

c)使用所述探针寡核苷酸作为引物在PCR扩增反应中扩增所述加标签的靶核酸序列，其中所述PCR扩增反应由退火温度Ta表征；

其中在包含与所述调节序列互补的序列区段的调节寡核苷酸存在下实施该PCR扩增反应，其中所述调节寡核苷酸包含第二标记物并具有解链温度Tm2；和

d)检测所述PCR扩增反应的产物；

其中所述第一标记物和所述第二标记物构成荧光报告物/猝灭剂对；且其中Tm1和Tm2二者都高于Ta。

在实施方案中，使用PCR反应将标签序列掺入加标签的靶核酸序列。