[发明专利]基于探针的核酸检测

权利要求书

1.一种用于检测靶核苷酸序列的方法，所述方法包含：

a)用核苷酸标签序列将所述靶核苷酸序列加标签，从而制备加标签的靶核酸序列；

b)提供包含与所述核苷酸标签序列互补的核苷酸标签识别序列和在所述核苷酸标签识别序列的5'的调节序列的探针寡核苷酸，其中所述调节序列不与所述核苷酸标签序列杂交，且其中所述探针寡核苷酸包含第一标记物并具有解链温度Tm1；

c)使用所述探针寡核苷酸作为引物在PCR扩增反应中扩增所述加标签的靶核酸序列，其中所述PCR扩增反应由退火温度Ta表征；

其中在包含与所述调节序列互补的序列区段的调节寡核苷酸的存在下实施所述PCR扩增反应，其中所述调节寡核苷酸不与所述核苷酸标签识别序列杂交，且其中所述调节寡核苷酸包含第二标记物并具有解链温度Tm2；和

d)检测所述PCR扩增反应的产物；

其中所述第一标记物和所述第二标记物构成荧光报告物/猝灭剂对；且其中Tm1和Tm2二者都高于Ta。

2.根据权利要求1所述的方法，其中使用PCR反应将所述核苷酸标签序列掺入所述加标签的靶核酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸标签识别序列与所述核苷酸标签序列完全互补。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述调节寡核苷酸包含与所述调节序列完全互补的序列区段。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述调节寡核苷酸具有15-45个核苷酸范围的长度。

6.根据权利要求1所述的方法，其中Ta呈55-62℃的范围。

7.根据权利要求1所述的方法，其中Ta呈60-64℃的范围。

8.根据权利要求1所述的方法，其中Ta呈60℃-62℃的范围。

9.根据权利要求1所述的方法，其中Tm1比所述退火温度(Ta)高至少25℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其中Tm2比所述退火温度(Ta)高至少2℃。

11.根据权利要求10所述的方法，其中Tm2呈60-75℃的范围。

12.根据权利要求8所述的方法，其中在大于500nL的反应体积中实施所述PCR扩增反应。

13.根据权利要求12所述的方法，其中在包含96-1536孔的多孔板中实施所述PCR扩增反应。

14.根据权利要求8所述的方法，其中在小于100nL的反应体积中实施所述PCR扩增反应。

15.根据权利要求14所述的方法，其中在微流控装置中实施所述PCR扩增反应。

16.根据权利要求14所述的方法，其中Ta为60℃。

17.根据权利要求8所述的方法，其中所述PCR扩增反应包含在所述退火温度(Ta)下的至少20个循环。

18.根据权利要求9所述的方法，其中Tm2比所述退火温度(Ta)高至少4℃。

19.根据权利要求9所述的方法，其中Tm2比所述退火温度(Ta)高至少10℃。

20.根据权利要求8所述的方法，其中在大于1μL的反应体积中实施所述PCR扩增反应。