[发明专利]用于测定分析物与配体的固有结合参数的方法、用于从一群分析物中选择分析物的方法、所选择的配体或分析物及传感器

说明书

本发明涉及用于测定分析物与配体的固有结合参数的方法、用于从一群分析物中选择分析物的方法、所选择的分析物或配体及用于这些方法的传感器。

在药物开发及其用于治疗和预防的用途中，了解分析物与配体的固有结合参数是重要的。在这方面，分析物和配体可以包含药物和蛋白质、药物和受体以及抗体和抗原。显而易见的是，依赖于预期用途，配体和分析物可以是可互换的，例如作为配体的抗体与作为分析物的抗原的结合。类似地，配体可以与传感器载体结合，并且配体存在于待与固定的分析物接触的溶液中。但通过定义，固定至载体（所述载体在这种情况下是传感器载体）的分子被称为配体，并且溶液中的分子被称为分析物并待与配体接触，以便结合且从而测定结合参数，例如亲和和解离常数、平衡解离常数（K_D）、平衡结合常数（K_A=1/K_D）、解离速率常数（k_d）和结合速率常数（k_a）。

结合参数例如此类相互作用对的亲和常数可以通过多种常规技术例如等温量热法、荧光各向异性等进行测定。目前优选的是无需标记配体或分析物而使用的测定技术。随后例如通过表面等离振子共振，在传感器载体的传感器表面上测量在配体和分析物两者之间的生物学相互作用。

分析物与配体的结合导致在生物传感器的响应中的可测量变化，其根据时间进行记录。这个记录导致所谓的传感图。

分析物转运至传感器表面用于与固定的配体结合包括与配体结合和从配体释放分析物的动力学。这个动力学结合和释放依赖于分析物在传感器表面上的流速，并且特别依赖于配体表面密度。此外，必须记住生物分子例如免疫球蛋白（Ig）包含分析物的两个或更多个结合侧面，从而使得在一方面配体和另一方面分析物两者之间不存在1:1相互作用。

结合参数例如关于特定配体的亲和常数通过给定表面密度可接受地测定，配体随后以所述给定表面密度暴露于两个或更多个分析物浓度。对所得到的传感图实施拟合程序，导致结合参数以及R_max的测定，所述R_max代表分析物与传感器表面上的所有可用配体的结合。

这种测定结合参数的方法具有若干缺点。一个缺点是再结合。当分析物与配体结合时，发现特定R_max。分析物随后可以释放且其后可以与另一个配体分子再结合。然而，在这个结合、释放和再结合过程中，分析物不离开用于由生物传感器测量的消逝场（evanescent field）或窗口。相应地，无法测量分析物的释放。这意味着解离速率将测量为太低，这可以导致与实际固有解离平衡常数（和解离速率）的差异。

另一个缺点是1:1相互作用（如上所示）不一定存在。如果分析物或配体包含两个结合侧面（具有相等或不同的结合强度），则结果是所谓的双相表现。进一步地，将发生经由两个结合侧面的结合，并且随后当更多分析物分子被结合或捕获时，结合侧面之一（结合强度更小的侧面）将被释放，并且结合进一步的分析物分子。这个问题对于抗体和抗原是特别相关的。

另外，当分析物分子在所谓的停滞层中扩散时，发生称为大量转运限制的物理速率测定过程，这影响分析物与传感器表面上固定的配体的结合的结合速率常数。在层流条件下注入分析物的过程中，分析物在这个非搅拌的停滞层中扩散并且将由表面捕获。当分析物浓度相对低且传感器的容量很高时，动力学过程是有限的扩散或有限的大量转运。这导致起始线性结合过程（δ折射单位（RU）/秒），其依赖于分析物的浓度、温度和决定停滞层厚度的流动条件。当配体密度更低时，大量转运（mass transport）限制效应更小。

相应地，在计算生物分子相互作用的速率和亲和常数中可能存在问题。众所周知如果在传感器载体的传感器芯片表面上发生固定/捕获分子的再结合效应、双相行为、大量转运限制和/或立体阻碍，则表观速率和亲和常数k_d、k_a和K_D将显著改变。

本发明的目的是避免这些问题，并且从而使得测定分析物与配体的固有结合参数可行。这意味着测定的结合参数不再依赖于目前使用的测定方法的缺陷，并且特别是不依赖于在其下执行测定的条件（例如配体密度、分析物浓度以及在配体和分析物两者之间的相互作用类型）。