[发明专利]P0基因沉默构建体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于在植物中，尤其是在糖用甜菜植物中传递对一种或多种病毒，尤其是对甜菜轻型黄化病毒（BMYV）和对甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）或仅对BMYV的病毒抗性或耐受性的方法。此外，本发明涉及根据这种方法获得的抗病毒或耐受病毒的植物，以及涉及由其衍生的种子和后代。

本发明还涉及基因沉默构建体，尤其是介导BMYV，或BMYV和BNYVV RNA沉默的发夹构建体和它们的应用。

背景技术

对于许多主要农作物植物病毒是严重的问题，因为病毒感染引起极大的收获损失。

在糖用甜菜中，主要病因有：（i）由其主要载体桃蚜（Myzus persicae）以持久性方式传播的马铃薯卷叶病毒属（polerovirus）、甜菜轻型黄化病毒（BMYV）引起的黄化；（ii）由通过多粘菌蚜传播（Polymyxa betae）的甜菜坏死黄脉病毒属（benyvirus）、甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）引起的糖用甜菜丛根病。抗BNYVV抗性的广泛使用使得能够保持产量，然而，正在出现破坏抗性的病毒分离株，因此迫切需要新的抗性变体。

一旦土地受到感染，真菌传播的病毒，如BNYVV可以在土壤中以休眠孢子保持数年。由于在植物中或在土壤中还没有用于消除这种病毒的有效的化学或物理方法，对于糖用甜菜菜农来说唯一的选择是使用遗传性抗病品种。几家公司已经通过育种提供了多种耐受性的，甚至部分抗性的变种。然而，这是一个非常繁琐和耗时的过程，通常需要很长的时间才能获得有用的抗性植物。

植物工程领域的快速变革已经引发了新策略的开发以赋予对病毒的遗传抗性。通过引入部分病毒基因组序列而由此将病毒序列（构建体）转化到植物细胞和植物中的对病毒性疾病抗性，已经成为抗性的新来源。

糖用甜菜被称为基因工程中的顽固物种，使可能的成功诱导病毒抗性变得复杂化。

已经公开了工程耐受性的几个实例，例如，通过在糖用甜菜基因组中转化和表达BNYVV衣壳蛋白序列（WO91/13159），尽管对整个功能性转基因糖用甜菜植物的报道来说这仅是很少的数据，如公开于EP1169463B1中的那些。具体而言，这些报道显示，关于在感染的病状中观察到的用编码BNYVV衣壳蛋白序列的基因转化的转基因糖用甜菜植物的抗性水平的数据有限。

甜菜坏死黄脉病毒（BNYVV）的基因组由五个正义RNA组成，其中的两个（RNA1和RNA2）编码对感染所有植物至关重要的功能，而其他三个（RNA3、RNA4和RNA5）涉及糖用甜菜（甜菜）根的载体介导的感染。由RNA2上称之为三基因连锁（TGB）的一组三个连续的稍微重叠的病毒基因决定BNYVV的细胞至细胞之间的移动，这三个基因依次编码病毒蛋白P42，P13和P15（基因产物由其以千道尔顿计而计算的Mr命名）。

BMYV的基因组由具有六个主要的开放阅读框（ORF0-5）的线性正义RNA组成。ORF1和ORF2编码涉及病毒复制的蛋白质，而其他3个ORF（ORF3、ORF4和ORF5）每一个编码结构蛋白（主要和次要的衣壳蛋白）和推定的运动蛋白（putative movement protein）进行。

已经证明BMYV的P0蛋白具有较差的表达，这是P0AUG不利起始密码子背景和维持低表达的强烈倾向的后果。此外，这部分的基因组是高度可变的，而已经探索研究此序列多样性用于区分不同的种。

已经证明由BNYVV所致的疾病能够地域性地扩张，其速度取决于许多当地环境和农业要素的组合。因此，有必要改进遗传抗性的机制，这可能，单独或组合地，赋予工业用途种植的糖用甜菜植物以稳定而持久的抗性。

现有技术的状态

专利申请WO2007/128755公开了一种TGB-3序列，其用于降低和/或抑制植物中野生型TGB-3的有害作用，以产生抗病毒性转基因植物，尤其是糖用甜菜对甜菜坏死黄脉病毒的抗性。

Carmen Simon-Mateo et al.，Biochimica et.，Biophysica Acta，1809No.11-12，722-731，2011公开了最近25年内用于获得病毒抗性植物的抗病毒策略。

A.Kozlowska-Maku1ska et al.，Journal of General Virology Vol.91，No.4，1082-1091，2010公开了来自甜菜感染马铃薯卷叶病毒属甜菜褪绿黄化病毒和甜菜轻型黄化病毒的不同分离株的P0蛋白的RNA沉默抑制物活性。