[发明专利]用于密度梯度分离的方法和插入件

说明书

相关申请

本申请要求于2011年5月5日提交的共同未决的美国临时申请No.61/482,886的优先权，上述申请的内容通过引用完整地被合并于本文中。

技术领域

本申请涉及一种用于分离细胞群的设备和方法，并且更具体地涉及用于离心管的插入件和使用密度梯度分离来分离细胞群的方法。

背景技术

在许多应用中，期望富集或替代地耗尽生物样本中的细胞群。血液学、免疫学和肿瘤学的领域依赖于外周血和来自相关组织（例如骨髓、脾、胸腺和胎肝）的细胞悬液的样本。特定细胞类型从这些不均匀样本的分离对于这些领域中的研究以及某些恶性肿瘤和免疫/造血障碍的诊断和治疗是关键。

诸如T细胞和抗原递呈细胞的免疫细胞的纯化群是免疫功能的研究所必需的并且在免疫疗法中使用。细胞、分子和生化过程的研究需要孤立地分析某些细胞类型。许多技术已用于分离T细胞亚群、B细胞、嗜碱粒细胞、NK细胞和树突细胞。

造血干细胞的分离也已成为很感兴趣的领域并且纯干细胞群将促进造血的研究。从外周血、脐带血和/或骨髓移植造血细胞越来越多地与高剂量化学疗法和/或放射疗法组合使用以便治疗包括恶性、非恶性和遗传性疾病的各种疾病。这样的移植物中的很少细胞能够长期造血重建，并且因此强烈需要开发用于纯化造血干细胞的技术。

此外，严重并发症和甚至移植程序的成功在很大程度上取决于用于去除对移植受体构成风险的移植物中的细胞的程序的有效性。这样的细胞包括同种移植物中为移植物抗宿主疾病（GVHD）负责的T淋巴细胞，和可能导致恶性生长的复发的自体移植物中的肿瘤细胞。通过去除非必要细胞并且因此减小待输注的冷冻保存液（cyropreservant）的体积而紧实移植物也是重要的。

在某些情况下，期望去除或耗尽来自生物样本，例如骨髓移植物中的肿瘤细胞。支气管、乳腺导管以及胃肠道和泌尿生殖道的上皮癌代表如今看到的实体性肿瘤的主要类型。微转移肿瘤细胞迁移被认为是患有上皮癌的患者的重要预后因素。检测这样的转移性细胞的能力受到组织或流体采样的有效性和肿瘤检测方法的灵敏性限制。富集血液样本中的循环上皮肿瘤细胞的技术增加检测转移性疾病的能力并且便于这样的罕见细胞的研究和能够进行疾病扩散的生物变化的确定。

造血细胞和免疫细胞在物理特性，例如密度的基础上并且在对杀死连续分裂细胞的某些药理学试剂的易感性的基础上进行分离。细胞表面抗原的单克隆抗体的出现大大增加了区分和分离不同细胞类型的可能性。使用单克隆抗体使细胞群从血液和相关细胞悬液分离有两种基本方法。它们的区别在于用（一种或多种）抗体区分/标记的是期望细胞还是非期望细胞。

在阳性选择技术中，期望细胞用抗体进行标记并且从剩余未标记/非需要细胞去除。在阴性选择中，非需要细胞被标记并且被去除。抗体/补体治疗和免疫毒素的使用是阴性选择技术，但是荧光激活细胞分选（FACS）和多数分批免疫吸附技术可以适合于阳性和阴性两种选择。在免疫吸附技术中，细胞用单克隆抗体进行选择并且优选地结合到可以从细胞的剩余物去除的表面，例如珠柱、瓶、磁性颗粒。免疫吸附在临床上和研究中赢得赞同，原因是它们用单克隆抗体保持靶细胞的高特异性，但是不同于FACS，它们可以按比例扩大以直接处理临床采集中的大量细胞并且它们避免使用细胞毒性试剂，例如免疫毒素和补体的危险。然而它们需要使用“设备”或细胞分离表面，例如珠柱、淘瓶或磁体。

不管特定方法如何，用于从血液分离特定细胞（例如造血干细胞、免疫细胞和循环上皮肿瘤细胞）的当前技术大体上包括去除红血细胞（RBC）的初始步骤。密度分离通常用于从外周血液去除RBC。Ficoll-Paque^TM（Ficoll）（Amersham Pharmacia Biotech AB，乌普萨拉，瑞典）是用于该应用的使用最广泛的密度分离介质（DSM）。其它DSM包括Lymphoprep^TM（Axis-Shield，挪威），和RosetteSep^TM DM-L（STEMCELL Technologies，加拿大）。在Ficoll密度分离中，将全血层叠在Ficoll上并且然后离心。RBC和粒细胞沉淀到细胞团块并且单核细胞保持在Ficoll-血浆界面处。该技术的成功依赖于单核细胞、粒细胞和RBC之间的密度的差异，由此单核细胞在Ficoll中漂浮而RBC和粒细胞则不然。