[发明专利]霉菌的检测方法、PCR用反应液、及霉菌检测用载体

说明书

技术领域

本发明涉及霉菌的检测方法，特别涉及用于高精度且特异性地检测广泛种类的霉菌的霉菌检测方法、PCR用反应液、及霉菌检测用载体。

背景技术

近年来，在食品制造现场或临床现场、文化财产保护环境等中，检查是否存在霉菌等微生物来确认安全性，并且防止其繁殖变得很重要。

这样的霉菌检查中，通常，从环境中采集试样，进行前期培养，接着，在对各菌种最佳的培养基中进行约20天的培养后，观察形态的特征，由此，进行鉴定霉菌的形态观察法(培养法)(参照专利文献1)。

但是，该方法中，需要对每个霉菌种类进行分离培养，因此，存在检查工序变烦杂的问题。另外，培养需要长时间，因此，具有例如对于人生活的室内的检查或食物的检查等要求迅速性的检查而言不适合的问题。另外，也存在如没有形成表示形态特征的胞子则无法鉴定，有时浪费劳力的问题。

另外，最近，在霉菌的检查中，也进行使用了基因的鉴定法。例如，将从环境中采集的试样培养后，从培养细胞中提取DNA，通过PCR(聚合酶链反应)法使靶区域扩增，对该扩增产物进行分析，由此，进行试样中的霉菌鉴定。作为对扩增产物进行分析的方法，提出了例如通过电泳来分析扩增产物的尺寸的方法、使用将与扩增产物互补结合的探针固定的DNA芯片来鉴定在试样中存在的霉菌的方法等(参照专利文献2～6)。

专利文献1：日本特开2007-195454号公报

专利文献2：日本特开2008-35773号公报

专利文献3：日本特开2008-278848号公报

专利文献4：日本特开2008-278861号公报

专利文献5：日本特开2010-4879号公报

专利文献6：日本特开2009-284832号公报

发明内容

发明要解决的问题

但是，即使通过这样的使用基因的鉴定法，在霉菌种类内的类似性高的情况下，仅由单一的靶基因的有无和尺寸来特定种类也极困难，存在例如不适于要求种群水平的鉴定准确度的检查的问题。

在此，专利文献2～4中，以各种霉菌的基因中的ITS(Intemal Transcribed Spacer)区域作为扩增对象区域，进行鉴定。在基于这样的ITS区域的霉菌的鉴定中，随着霉菌的种类增加，假阳性反应也增加，存在检查精度降低的问题。

另一方面，在专利文献5、6中记载了以β-微管蛋白基因作为扩增对象区域来进行鉴定。这些文献中公开了，通过以β-微管蛋白基因作为扩增对象区域，能够检测特定种类的霉菌。

但是，如仅以β-微管蛋白基因作为扩增对象区域，则与仅以ITS区域作为扩增对象区域的情况同样，存在有时发生假阳性反应的问题。

本发明人进行了深入的研究，结果发现，通过将ITS区域和β-微管蛋白基因二者作为扩增对象区域使用，能够高精度地检测广泛种类的霉菌，从而完成了本发明。另外，也发现了用于能够使ITS区域与β-微管蛋白基因同时在反应系统中有效扩增的条件。

但是，如上所述，进行形态鉴定的方法中，为了发现形态的特征，需要对每个菌种而言的最佳培养基和长期的培养，另外，鉴定需要熟练，因此，存在不适于迅速检查和检查的简易化的问题。

另外，在基于PCR及序列分析的方法中，为了对各菌种分别培养，需要约14天的比较长的检查期间，另外，由于需要对各菌种分别分析，因此，存在不适于要求多检体处理的情况的问题。

相对于此，根据基于DNA芯片的新型检测方法，理论上，能够一次检测多种霉菌，被期待作为迅速并且简易的检查方法。

另一方面，基于适于生长的湿度，霉菌被分成嗜干性霉菌(喜好干燥状态)、耐干性霉菌(能耐受干燥)、及嗜湿性霉菌(喜好湿润状态)，它们需要通过各自适合的不同的培养基进行培养。另外，在上述的以往通常进行的第一及第二方法中，需要对各菌种分别培养，因此，并不存在，将多种霉菌混合培养、再在此基础上分别检测各个霉菌这样的概念。因此，以往不存在将嗜干性霉菌、耐干性霉菌及嗜湿性霉菌同时培养而能够特异地检测各个霉菌的技术。

本发明是鉴于上述情况进行的，其目的在于，提供霉菌的检测方法、在该检测方法中使用的PCR用反应液、及霉菌检测用载体，所述霉菌的检测方法中，将试样中的霉菌的基因组DNA中的ITS区域及β-微管蛋白基因扩增，通过确认该扩增产物的有无来进行霉菌的鉴定。