[发明专利]用于在预选位点修饰植物基因组的方法和手段

说明书

发明领域

本发明涉及农艺学领域。更具体地，本发明提供了使用胚性愈伤组织在棉花植物的基因组中精确定位的核苷酸序列上引入靶向修饰的方法和手段，该靶向修饰包括插入、缺失或取代。

背景技术

在植物基因组中引入靶向修饰的需求（包括控制在植物中外源DNA整合的定位）已变得日益重要，并且为了满足这一需求，已经开发了若干方法（综述参见Kumar（库马尔）和Fladung（弗拉东），2001,Trends in Plant Science（《植物科学趋势》），6,pp155-159）。这些方法大部分依赖于经由双链断裂诱导（DSBI）酶的表达，在靶向位置初始引入的双链DNA断裂。

经由罕见切割内切核酸酶（例如I-SceI），通过诱导双链DNA断裂（DSB），激活靶基因座和/或修复或供体DNA，已经示出出增加若干数量级的同源重组的频率（Puchta（普赫塔）等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（美国国家科学院院刊）），93,pp5055-5060;Chilton（奇尔顿）和Que（秋），Plant Physiol.（《植物生理学》），2003;D’Halluin（阿吕安）等人，2008Plant Biotechnol.J.（《植物生物技术杂志》）6,93-102）。

WO96/14408描述了一种编码酶I-SceI的分离DNA。这种DNA序列可以并入克隆和表达载体、转化细胞系和转基因动物中。在基因作图和基因的定点插入中这些载体可以是有用的。

WO00/46386描述了通过I-SceI诱导的双链断裂，在细胞中修饰、修复、减弱和灭活一个基因或其他染色体DNA的方法。还披露了在需要其的个体中治疗或预防遗传性疾病的方法。进一步披露了嵌合的限制性内切酶。

WO2005/049842描述了使用罕见分裂“双链断裂”诱导（DSBI）酶连同改进的I-SceI编码核苷酸序列改进植物中靶向DNA插入的方法和手段。

WO2006/105946描述了用于通过同源重组在植物细胞和植物中将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而在去除步骤期间不遗留痕迹并且不依靠体外培养，采用其中描述的方法用于通过小孢子特异性表达的DSBI罕见分裂内切核酸酶去除选择的DNA。

WO2008/037436描述了WO2006/105946方法和手段的变体，其中通过双链断裂诱导罕见分裂内切核酸酶诱导的选择的DNA片段的去除步骤处于种系特异启动子的控制下。该方法的其他实施例依赖在修复DNA的一端的非同源末端-连接和在另一端的同源重组。WO08/148559描述了WO2008/037436方法的变体，即在真核细胞中（例如植物细胞）中通过同源重组用于将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而不遗留痕迹,采用用于去除在直接重复中侧翼是两个核苷酸序列的选择的DNA的方法。

WO2003/004659披露了重组系统以及用于从真核生物染色体DNA去除核酸序列的方法。本发明还涉及转基因生物（优选地植物），包含所述系统或由所述方法产生。

WO2006/032426披露了改进的重组系统以及用于从植物基因组中消除标记序列的方法。具体地，本发明基于一种表达盒的用途，该表达盒包括欧芹泛素启动子，以及可操作地连接到其上的编码特异DNA-核酸内切酶序列的核酸序列。

WO2009/006297披露了用于改变单子叶植物细胞和单子叶植物的基因组的方法和组合物，涉及使用双链断裂诱导剂以改变单子叶植物或植物细胞基因组序列，该序列包括用于双链断裂诱导剂的识别序列。

WO2004/006667描述了经由体细胞胚发生的棉花的再生和农杆菌介导的转化的改进方法。

WO2005/103271描述了经由农杆菌介导的T-DNA接合至悬浮液-培养的细胞或愈伤组织用于高效植物转化的方法，采用过滤器的膜作为用于T-DNA供体和受体的共培养的多孔固体支持物。