[发明专利]用于在预选位点修饰植物基因组的方法和手段

权利要求书

1.一种用于在预定义位点修饰棉花植物细胞基因组的方法，该方法包括以下步骤

a.在所述预定义位点或其附近诱导双链DNA断裂，所述双链断裂是通过向所述细胞引入罕见分裂内切核酸酶诱导的，该罕见分裂内切核酸酶在所述预定义位点或其附近识别一个识别序列；

b.选择一种植物细胞，其中所述双链DNA断裂已经被修复，导致了在基因组中在所述预选位点的修饰，其中所述修饰选自

i.至少一个核苷酸的取代；

ii.至少一个核苷酸的缺失；

iii.至少一个核苷酸的插入；或者

iv.i.-iii.的任何组合；

其特征在于所述细胞包括在脆弱胚性愈伤组织内，其中在包括活性炭的培养基上诱导所述脆弱胚性愈伤组织并维持在暗光条件下，其中所述暗光条件的光强度是1至7μmol m-2sec-1，光周期是16H光/8H黑暗。

2.如权利要求1所述的方法，其中通过将编码所述内切核酸酶的DNA分子递送至所述细胞中，将所述内切核酸酶引入所述细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中先于步骤b.，将一种外源修复DNA分子递送至所述细胞中，所述外源修复DNA分子被用作用于修复所述双链DNA断裂的模板。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述胚性愈伤组织诱导自下胚轴外植体。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之前、之中和之后，将所述胚性愈伤组织在没有激素的培养基中进行孵育。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之前和之后，将所述胚性愈伤组织在固体培养基上进行孵育。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之中或之后，将所述胚性愈伤组织在非选择性培养基上孵育1至4天。

8.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA递送通过粒子轰击实施。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述轰击用0.5pmol外源修复DNA和/或0.5pmol内切核酸酶编码DNA实施。

10.如权利要求8或9所述的方法，其中在轰击之前，所述胚性愈伤组织在包括0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的培养基上孵育2至20小时。

11.如权利要求8所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之中或之后，将所述胚性愈伤组织在包括0.2M甘露醇的非选择性培养基上孵育1至4天。

12.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA递送使用农杆菌属实施。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述DNA递送通过在包括100μM乙酰丁香酮和/或100mg/l L-半胱氨酸的培养基中将所述胚性愈伤组织与所述农杆菌属共培养三天实施。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述转化之后，所述胚性愈伤组织在包括250mg/L或125mg/L triacillin的培养基上孵育。

15.根据权利要求3和12-13中任一项所述的方法，其中所述外源修复DNA包括至少一个侧翼核苷酸序列，该核苷酸序列与所述预定义位点的上游或下游DNA区域具有充分同源性，以允许与所述上游或下游DNA区域重组。

16.根据权利要求3和12-13中任一项所述的方法，其中所述外源修复DNA包括两个位于所述外源DNA相反端的侧翼核苷酸序列，一个所述侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的上游DNA区域具有充分同源性，另一个侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的下游序列具有充分同源性，以允许所述侧翼核苷酸序列与所述上游和下游DNA区域之间的重组。

17.根据权利要求3和12-13中任一项所述的方法，其中所述外源修复DNA包括一个可选择性标记基因。

18.根据权利要求3和12-13中任一项所述的方法，其中所述外源DNA包括一个感兴趣的植物可表达基因。