[发明专利]蛋白酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及丝氨酸蛋白酶，尤其是可在多种应用、特别是在去垢剂中使用的真菌丝氨酸蛋白酶。本发明涉及编码所述酶的核酸分子、重组载体、生产所述酶的宿主细胞、包含所述酶的酶组合物，以及制备该组合物的方法。本发明还涉及所述酶的多种应用和包含所述酶的组合物。 

背景技术

微生物蛋白酶是最重要的水解酶之一，并在例如去垢剂、食品、皮革、制药、诊断、废物管理和银回收等多项工业领域中取得应用。微生物细胞外蛋白酶占据世界范围内工业用酶销量的主要部分（Cherry和Fidantsef，2003）。大约90%的市售的蛋白酶是去垢剂酶（Gupta等人，2002）。目前使用的市售去垢剂制剂包含自然形成的枯草杆菌蛋白酶家族的碱性丝氨酸蛋白酶（EC3.4.21）或者来源自芽孢杆菌种的枯草杆菌蛋白酶（EC3.4.21.62），或者是其重组蛋白酶的制剂（Maurer，2004）。 

商业化蛋白酶的例子有Subtilisin CarlsbergSubtilisin309 Subtilisin147和冷洗蛋白酶(丹麦Novozymes A/S)、Ox、  Prime和(美国Genencor国际公司)，以及BLAP S和X series（德国Henkel）。 

几种碱性丝氨酸蛋白酶和编码这些酶的基因也已经从包括酵母和丝状真菌的真核生物中被分离出来。美国专利No.3652399和EP519229（日本Takeda Chemical Industries有限公司）公开了一种碱性蛋白酶，它来源于镰孢菌属（无性生殖状态，有性型）或者赤霉菌属（有性生殖状态，无性型），尤其是来源于可在去垢剂和其他清洁剂组分的配方中使用的镰孢菌属sp.S-19-5（ATCC20192，IFO8884）、尖孢镰刀菌胡麻专化型（IFO5880）或者小麦赤霉菌（ATCC20193，IFO6608)。WO1994025583（丹麦Novo Nordisk A/S）公开了源自于镰孢菌属、尤 其是一株尖孢镰刀菌菌株（DSM2672）的活性类胰蛋白酶，以及编码它的DNA序列。来源于木贼镰孢菌和锐顶镰刀菌的丝氨酸蛋白酶的氨基酸及核苷酸序列已经分别公布于WO2010125174和WO2010125175（芬兰AB Enzymes Oy)。并且，来源于如麦轴梗霉属和耳霉属等真菌种的碱性蛋白酶已经被报道过（摘要见Anwar和Saleemuddin1988）。 

在液态去垢剂中使用蛋白酶的主要问题是它们的不稳定性。在液态去垢剂中，酶与水以及如阴离子表面活性剂和络合剂的离散剂直接接触，这会导致不可逆变性。蛋白酶降解包括去垢剂配方中的其他酶和其自身的蛋白质。自身蛋白质水解通过表面活性剂和高温得到加强。因此，包含蛋白酶的液态去垢剂的稳定性代表着产品研发中一个主要的挑战（Maurer，2010）。 

为了改进工业用丝氨酸蛋白酶的稳定性，已经使用了多种方法。WO92/03529（丹麦Novo Nordisk A/S）、US2009/096916（美国Genencor国际公司）和WO2007/145963（美国Procter&Gamble公司）公开了一种可逆的肽或蛋白型的蛋白酶抑制剂的使用。包含蛋白酶的液态去垢剂组分通常包括蛋白酶抑制剂，如含有或不含多元醇的硼酸，以抑制蛋白酶的活性。此类抑制剂的一个例子是公开于US2010/0120649（丹麦Novozymes A/S）的4-甲酰苯基硼酸（4-FPBA）。蛋白酶的稳定性还通过联合使用卤盐与多元醇得到改进（WO02/08398,美国Genencor国际公司）。EP0352244A2（丹麦NovoNordiskA/S)建议通过使用两性化合物、例如表面活性剂来改进源自于芽孢杆菌的酶的稳定性。 

基于由晶体结构和同源蛋白之间的序列相似性比较所得到的信息，可以设计出具有改良的稳定性和/或改良的性能的蛋白质变体。通过定点和/或随机突变，已经研发出具有改良的催化效率和/或针对温度、氧化剂和不同洗涤条件具有更好的稳定性以及具有改进的液态去垢剂储藏稳定性的天然丝氨酸蛋白酶的变体。